三叶青根多糖对HepG2细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响

王斌, 成亚飞, 武杰, 李刚磊, 王世明

(山西医科大学 第一医院 普通外科, 山西 太原 030000)

肝癌是常见的恶性肿瘤之一，具有较高的发病率[1].近年来，尽管随着肝癌诊断和治疗技术的提高，患者预后有了较大改善，但仍有部分患者体内肿瘤易发生复发和转移，极大地威胁着患者健康[2].因此，寻找有效的肝癌治疗药物对于肝癌的治疗具有重要意义.三叶青是一种江浙地区传统的中药，主要活性成分包括黄酮、多糖、山奈酚等，具有抗病毒、抗炎、抗肿瘤等生物学功效[3-5].三叶青根多糖(polysaccharides from roots ofRadixTetrastigma，RTP)是从三叶青块根中提取得到的多糖，研究显示，其可抑制胃癌细胞的增殖，诱导癌细胞凋亡[6].目前，三叶青根多糖对肝癌细胞生物学行为的影响还尚未可知，故本研究以肝癌细胞HepG2为研究对象，探讨三叶青根多糖对HepG2细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响及可能的作用机制，以期为肝癌治疗药物的研发提供一定的新方向.

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

肝细胞L-02购自上海研谨生物科技有限公司；肝癌细胞HepG2购自中国科学院上海细胞库；三叶青根购自上饶市红日农业发展有限公司，三叶青根多糖参照文献[7]方法提取；胎牛血清(FBS)购自浙江天杭生物科技股有限公司；RPMI 1640培养基购自北京索莱宝科技有限公司；胰蛋白酶和噻唑蓝(MTT)购自美国Sigma公司；LipofectamineTM2000试剂盒和Trizol试剂购自美国Invitrogen公司；逆转录试剂盒和PCR试剂盒购自大连宝生物工程有限公司；Annexin V-FITC/PI试剂盒购自上海复申生物科技有限公司；miR-151模拟物(mimics)及阴性对照(miR-NC)、miR-151抑制剂(anti-miR-151)和阴性对照序列(anti-miR-NC)购自上海GenePharma公司；PCR引物序列购自上海生工生物工程公司；鼠抗人P21、CyclinD1单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司；兔抗人Bcl-2、鼠抗人Bax单克隆抗体购自北京中山生物技术有限公司；鼠抗人MMP2、Ecadherin单克隆抗体购自美国ZYMED公司.

VICTOR Nivo型酶标仪购自美国PerkinElmer公司，FACS Calibur型流式细胞仪购自美国Becton Dickinson公司，ZF-258型凝胶成像系统购自上海嘉鹏科技有限公司，ABI 7500型Realtime PCR仪购自美国Applied Biosystems公司.

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养

肝细胞L-02和肝癌细胞HepG2培养方法相同，均用含体积分数10% FBS的RPMI 1640培养基，置于37 ℃、体积分数为5%的CO2培养箱中培养.当细胞生长汇合度达80%左右时，胰蛋白酶消化，以1∶3比例进行传代培养.

1.2.2 筛选RTP作用的质量浓度和时间

取对数生长期的肝细胞L-02和肝癌细胞HepG2，调整密度为2.5×104/mL，接种于96孔板中，每孔200 μL.肝细胞L-02分为对照组(Con组)和不同质量浓度的RTP组，Con组细胞用不含RTP的培养基培养，不同质量浓度的RTP组细胞分别用含质量浓度为0.65、1.25、2.5、5、7.5、10 mg/mL RTP的培养基培养[6].分别培养24、48、72 h后，MTT检测肝细胞L-02增殖情况，以RTP组与Con组细胞吸光度值比较无统计学差异表示此质量浓度的RTP对肝细胞L-02无毒性，筛选出对肝细胞L-02无毒性的RTP质量浓度.HepG2细胞分为Con组和RTP组，Con组细胞用不含RTP的培养基培养，RTP组细胞加入对肝细胞L-02无毒性质量浓度的RTP培养，分别培养24、48、72 h后，MTT检测HepG2细胞增殖，筛选出RTP对HepG2细胞的最佳作用质量浓度和时间进行后续实验.

1.2.3 MTT法检测细胞增殖

细胞培养结束后，每孔加入20 μL的MTT溶液(质量分数为5 g/L)，继续孵育4 h.弃上清液，每孔加入150 μL 二甲基亚砜，充分振荡，待结晶紫溶解完全后，混合均匀，于酶标仪490 nm处测定光密度吸光度值D(490nm).实验重复3次.

1.2.4 HepG2细胞转染

对数生长期的HepG2细胞接种于6孔板中，当细胞生长汇合度达60%时，更换不含FBS的培养基，参照LipofectamineTM2000试剂盒操作说明书，分别将anti-miR-151、anti-miR-NC、miR-151 mimics及miR-NC转染至HepG2细胞，转染6 h后，更换新鲜培养基.qRT-PCR检测细胞中miR-151表达水平验证转染效果.继续培养至48 h后，胰蛋白酶消化，收集细胞，用于后续实验.

1.2.5 HepG2细胞分组

未转染的HepG2细胞分为Con组和RTP组，Con组用不含RTP的培养基培养，RTP组用含最佳质量浓度RTP的培养基培养.转染anti-miR-151、anti-miR-NC的细胞用不含RTP的培养基培养，并分别记为anti-miR-151组和anti-miR-NC组.转染miR-151 mimics、miR-NC的细胞用含最佳质量浓度RTP的培养基培养，并分别记为RTP+miR-151组和RTP+miR-NC组.

1.2.6 流式细胞仪检测细胞凋亡

未转染及转染后的HepG2细胞，调整密度为2.5×105/mL，接种于24孔板中.细胞贴壁后，按照1.2.5分组处理，每组设置3个复孔.培养48 h后，胰蛋白酶消化，收集细胞.取1×106个细胞，PBS清洗后，加入100 μL结合缓冲液重悬细胞.加入10 μL的Annexin V-FITC，室温避光反应10 min.再加入5 μL的碘化丙啶，室温避光反应10 min.加入400 μL结合缓冲液混匀，流式细胞仪检测细胞凋亡.

1.2.7 Transwell检测细胞迁移和侵袭

细胞迁移实验：未转染及转染后的HepG2细胞用不含FBS的RPMI 1640培养基调整细胞密度为2.5×105/mL.取100 μL细胞悬液加入Transwell上室，下室加入500 μL含体积分数10% FBS的RPMI 1640培养基.按照1.2.5分组处理，每组设置3个复孔.培养48 h后，取出Transwell小室，吸弃培养液.经多聚甲醛固定、结晶紫染色后，棉签擦去未迁移细胞，PBS清洗.显微镜观察，随机选取5个视野，计数.

细胞侵袭实验：实验前，先在上室铺设Matrigel基质胶(Matrigel与RPMI 1640培养基以体积比为1∶8的比例稀释)，自然晾干.然后在加入100 μL细胞悬液，剩余操作与细胞迁移实验相同.

1.2.8 qRT-PCR法检测细胞中mRNA的表达水平

各组细胞培养48 h后，Trizol试剂提取细胞中总RNA，紫外分光光度计检测RNA的纯度和浓度.选取D(260nm)/D(280nm)处于1.8～2.0范围内溶液，逆转录试剂盒将其逆转录为cDNA.然后以cDNA为模板，进行PCR扩增.扩增条件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 1 min，60 ℃ 30 s，共进行35个循环.引物序列见表1.miR-151以U6为内参，P21、CyclinD1、Bcl-2、Bax、E-cadherin和MMP-2均以GAPDH为内参，采用 2-ΔΔCt法计算miR-151及P21，CyclinD1，Bcl-2，Bax,E-cadherin和MMP-2的mRNA的相对表达水平.

表1 引物序列

1.2.9 Western Blot法检测蛋白表达水平

各组细胞培养48 h后，细胞裂解液提取细胞中总蛋白，4 ℃、12 000 r/min离心后收集上清液，BCA蛋白试剂盒测定蛋白质量浓度.取适量蛋白溶液，加入上样缓冲液，100 ℃煮沸5 min.蛋白变性后，行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳.电泳后，转至PVDF膜，将其置于质量浓度为5%的脱脂奶粉溶液中封闭1 h.TBST洗膜后，分别加入一抗P21(VP21∶V抗体稀释液=1∶1 000)、Cyclin D1(VCyclin D1∶V抗体稀释液=1∶1 000)、Bcl-2(VBcl-2∶V抗体稀释液=1∶800)、Bax(VBax∶V抗体稀释液=1∶800)、E-cadherin(VE-cadherin∶V抗体稀释液=1∶1 000)、MMP-2(VMMP-2∶V抗体稀释液=1∶1 000)和GAPDH(VGAPDH∶V抗体稀释液=1∶2 000)，4 ℃孵育过夜.次日，TBST洗膜后，加入辣根过氧化酶标记的山羊抗兔二抗(V二抗∶V抗体稀释液=1∶5 000)，室温孵育1 h.TBST洗膜后，加入ECL显影液，避光显影，凝胶成像系统曝光拍照.以GAPDH为内参，Image J软件分析目的蛋白相对表达水平.目的蛋白相对表达水平以其条带灰度值与GAPDH条带灰度值的比值表示.

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 RTP作用的质量浓度和时间的筛选

与Con组肝细胞L-02比，低质量浓度(0.65、1.25、2.5 mg/mL)的RTP对抑制肝细胞L-02细胞活性无统计学差异(P>0.05)，而高质量浓度(5、7.5、10 mg/mL)的RTP可抑制肝细胞L-02活性(P<0.05)，因此选择0.65、1.25、2.5 mg/mL的RTP作为对HepG2细胞作用的最佳质量浓度.与Con组比，RTP组HepG2细胞培养48 h和72 h后的活性、培养48 h后细胞中增殖相关因子Cyclin D1的mRNA和蛋白水平均显著降低(P<0.05)，肿瘤抑制因子P21的mRNA和蛋白水平均显著升高(P<0.05)，表明RTP可抑制HepG2细胞增殖(图1).质量浓度为1.25 mg/mL的RTP作用于HepG2细胞48 h时，HepG2细胞存活率接近50%，因此后续实验选择RTP的作用质量浓度为1.25 mg/mL，作用时间为48 h.

A: RTP对肝细胞L-02活性的影响；B：RTP对HepG2细胞的细胞活性的影响；C：RTP对HepG2细胞Cyclin D1和P21 mRNA表达的影响；D：RTP对HepG2细胞Cyclin D1和P21蛋白的表达的影响.1)与Con组比较，P<0.05；2)与RTP 0.65 mg/mL组比较，P<0.05；3)与RTP 1.25 mg/mL组比较，P<0.05.

2.2 RTP对HepG2细胞凋亡、迁移和侵袭的影响

与Con组比，RTP组HepG2细胞凋亡率、促凋亡因子Bax和迁移侵袭相关因子E-cadherin的mRNA和蛋白水平均显著升高(P<0.05)，迁移和侵袭细胞数、抗凋亡因子Bcl-2和迁移侵袭相关因子MMP-2的mRNA和蛋白水平均显著降低(P<0.05)，表明RTP可抑制HepG2细胞迁移和侵袭，并促进其凋亡(图2).

A：RTP对HepG2细胞凋亡的影响；B：RTP对HepG2细胞迁移、侵袭的影响，×200; C：RTP对HepG2细胞Bax、Bcl-2、E-cadherin和MMP-2的mRNA表达的影响; D：RTP对HepG2细胞Bax、Bcl-2、E-cadherin和MMP-2蛋白表达的影响.1)与Con组比较，P<0.05.

2.3 RTP对HepG2细胞中miR-151表达的影响

与Con组比，RTP组HepG2细胞中miR-151表达水平显著降低(P<0.05)，表明RTP可降低HepG2细胞中miR-151表达(表2).

表2 RTP对HepG2细胞中miR-151表达的影响

2.4 抑制miR-151对HepG2细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响

anti-miR-151组miR-151水平显著低于anti-miR-NC组(P<0.05)，表明miR-151抑制剂转染成功，HepG2细胞中miR-151表达被抑制(表3).与anti-miR-NC组比，anti-miR-151组HepG2细胞活性、迁移和侵袭细胞数及增殖相关因子Cyclin D1、抗凋亡因子Bcl-2和迁移侵袭相关因子MMP-2的mRNA和蛋白水平均显著降低(P<0.05)，HepG2细胞凋亡率及肿瘤抑制因子P21、促凋亡因子Bax和迁移侵袭相关因子E-cadherin的mRNA和蛋白水平均显著升高(P<0.05)，表明抑制miR-151可抑制HepG2细胞的增殖、迁移和侵袭，并促进其凋亡(图3).

A：抑制miR-151对HepG2细胞增殖的影响；B：抑制miR-151对HepG2细胞凋亡的影响；C：抑制miR-151对HepG2细胞迁移和侵袭的影响，×200；D：抑制miR-151对Bax、Bcl-2、E-cadherin和MMP-2的mRNA表达的影响；E：抑制miR-151对Bax、Bcl-2、E-cadherin和MMP-2的蛋白表达的影响.1)与anti-miR-NC组比较，P<0.05.

表3 抑制HepG2细胞miR-151表达的验证情况

2.5 过表达miR-151对RTP作用的HepG2细胞增殖的影响

与RTP+miR-NC组比，RTP+miR-151组HepG2细胞活性和增殖相关因子Cyclin D1的mRNA和蛋白水平显著降低(P<0.05)，肿瘤抑制因子P21的mRNA和蛋白水平显著升高(P<0.05)，表明过表达miR-151逆转了RTP对HepG2细胞的增殖的抑制作用(图4、表4).

A：过表达miR-151对RTP作用的HepG2细胞增殖的影响；B：过表达miR-151对RTP作用的HepG2细胞Cyclin D1和P21的mRNA表达的影响; C：过表达miR-151对RTP作用的HepG2细胞Cyclin D1和P21的蛋白表达的影响.1)与Con组比较，P<0.05；2)与RTP+miR-NC组比较，P<0.05.

表4 过表达miR-151对RTP作用的HepG2细胞miR-151表达的影响

2.6 过表达miR-151对RTP作用的HepG2细胞凋亡、迁移和侵袭的影响

与RTP+miR-NC组比，RTP+miR-151组迁移和侵袭细胞数及抗凋亡因子Bcl-2和迁移侵袭相关因子MMP-2的mRNA和蛋白水平均显著降低(P<0.05)，HepG2细胞凋亡率及促凋亡因子Bax和迁移侵袭相关因子E-cadherin的mRNA和蛋白水平均显著升高(P<0.05)，表明过表达miR-151逆转了RTP对HepG2细胞迁移和侵袭的抑制作用及凋亡促进作用(图5).

A：过表达miR-151对RTP作用的HepG2细胞迁移和侵袭的影响,×200；B：过表达miR-151对RTP作用的HepG2细胞凋亡的影响；C:过表达miR-151对RTP作用的HepG2细胞中E-cadherin和MMP-2的mRNA表达的影响;D：过表达miR-151对RTP作用的HepG2细胞中E-cadherin和MMP-2的蛋白表达的影响.

3 讨论

细胞增殖紊乱可诱发肿瘤[8].Cyclin D1是参与细胞周期调控和维持细胞正常增殖的关键蛋白，其表达升高可促进肿瘤细胞的增殖[9].P21基因是目前已被证实的肿瘤抑制因子，其表达升高可抑制肿瘤细胞增殖[10].本研究结果显示，三叶青根多糖可能通过上调P21蛋白表达和下调Cyclin D1蛋白表达抑制HepG2细胞的增殖.细胞凋亡是一种细胞自主生理性死亡，对机体的正常发育和自身稳定具有极其重要的作用，细胞凋亡失衡与肿瘤的发生发展有关，诱导肿瘤细胞凋亡是肿瘤治疗的一种手段[11].促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2是Bcl-2家族中重要成员.Bax表达的升高或Bcl-2表达的降低可诱导细胞凋亡[12].本研究结果显示，三叶青根多糖作用后，HepG2细胞凋亡率和Bax蛋白表达升高，Bcl-2蛋白表达降低，提示三叶青根多糖可能通过上调Bax蛋白表达和下调Bcl-2蛋白表达诱导HepG2细胞凋亡.肿瘤复发和转移是肿瘤患者治疗失败和死亡的主要原因.基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)是一类可降解基底膜和细胞外基质的酶类，参与调控肿瘤细胞的迁移和侵袭[13].上皮-间质转化是肿瘤细胞侵袭和转移的重要过程，上皮型钙粘蛋白(E-cadherin)是上皮-间质转化过程的主要标志性蛋白，其所介导的上皮细胞间的黏附可有效地抑制肿瘤的细胞迁移和侵袭[14].本研究结果显示，三叶青根多糖可能通过上调E-cadherin蛋白表达和下调MMP-2蛋白表达抑制HepG2细胞的迁移和侵袭能力.

微小RNA(microRNA，miRNA)是一类长度约为18～25个核苷酸的小分子非编码单链RNA，参与调控细胞增殖、凋亡、分化等生物学过程[15-16]，可作为抑癌或癌因子在肿瘤的发生和发展过程中发挥重要作用[17].研究显示，miR-151在甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma，PTC)组织中表达水平明显高于癌旁组织，其高表达与PTC患者病灶数量、局部侵犯、淋巴结转移和病理分期等临床病理特征密切相关[18]；miR-151高表达的前列腺癌患者存活率较低[19]；肝癌组织中miR-151表达上调，促进肝癌侵袭转移[20].本研究结果显示，抑制miR-151表达可抑制肝癌HepG2细胞的增殖、迁移和侵袭，并促进HepG2细胞凋亡，这与Ding等[21]报道的肝细胞癌中miR-151表达增加，miR-151过表达可促进肝癌细胞的侵袭和转移结果一致，提示miR-151作为促癌基因参与肝癌的发生和发展，是肝癌治疗的潜在分子靶点.研究显示，黄芪-莪术可通过下调miR-151表达诱导HepG2细胞凋亡[22].白藜芦醇可通过下调miR-151表达抑制HepG2细胞增殖，并诱导其凋亡[23].为了探讨三叶青根多糖发挥抗肝癌作用的分子机制，本研究采用qRT-PCR检测了三叶青根多糖对HepG2细胞中miR-151表达的影响，结果显示三叶青根多糖可抑制HepG2细胞中miR-151的表达.此外，过表达miR-151表达逆转了三叶青根多糖对HepG2细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响，提示三叶青根多糖可能通过下调miR-151表达影响HepG2细胞的生物学行为.

综上所述，三叶青根多糖可抑制肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭，并诱导其凋亡，可能与下调细胞中miR-151表达有关.本实验也存在一定的不足之处，接下来将进一步通过体内实验探讨三叶青根多糖对肝癌肿瘤生长的影响，为肝癌治疗药物的研发提供新方向.