一株土霉素降解菌的筛选鉴定及性能研究

曾 洪，孙文笑，邓熠鋆，高 榕,2，陈 礼,2，方 俊,2，梁运姗,2

(1.湖南农业大学资源环境学院，洞庭湖区农村生态系统健康湖南省重点实验室，湖南 长沙 410128;2.湖南农业大学生物科学技术学院，湖南省猪场废弃物无害化处理与资源化利用工程研究中心，湖南 长沙 410128)

土霉素是由龟裂链霉菌在机体新陈代谢过程中产生的一种次级代谢产物，对细菌、衣原体、支原体等特异性微生物具有强力抑制作用，故在养殖业中常被作为饲料添加剂使用[1-2]。土霉素在提高养殖效率方面的巨大贡献不容忽视，但畜禽动物对于土霉素的吸收并不完全，而国内滥用土霉素、畜禽粪便不加处理直接排放的行为随处可见[3]。有研究表明，2013年中国36种抗生素的消耗量为16.2万t，其中有约58%的抗生素被释放到环境中。流入环境的土霉素会对土壤微生物、植物乃至动物造成严重的生态毒害[4]。当前治理国内土霉素严重污染的首要任务，是控制土霉素作为饲料添加剂的添加量，使其趋于合理化；其次是通过科学的处理方法消除环境中残留的抗生素。主流的抗生素治理方法大致为物理、化学、生物降解三种。其中生物降解具有价格低廉、方法简单、降解效率高等优点[5]。在现有的报道中，已有学者筛选得到假胞杆菌(Pseudomonassp.) ，将菌株结合堆肥实验后土霉素去除率可达93.21%[6]；另有研究者筛选出短波单胞杆菌属(Brevundimonassp.)和类芽孢杆菌属(Paenibacillussp.)，通过添加不同的氮源和碳源以及金属离子，使菌株对土霉素的降解率分别提升到72.99%和71.04%[7]。但纵观已有的文献报道，高效降解土霉素的菌株种类仍显不足。因此，高效土霉素降解菌的筛选对于进一步处理环境中土霉素残留问题具有重大意义，并在环境深度修复方面存在着巨大的潜在应用前景。本研究从湖南大型养殖场固体废弃物中筛选出一株高效土霉素降解菌株，对其进行鉴定和降解性能研究，以期为高浓度土霉素环境中土霉素污染修复技术提供一定的技术支持，并为进一步高效消除残留土霉素提供菌株资源和理论研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料与试剂

从湖南省某大型养殖场内，取一定量的新鲜猪粪、堆肥原材料和堆肥腐殖质进行混合，置于4℃冰箱保存，作为筛菌原料。土霉素标准品(C22H24N2O9·HCl，HPLC≥98%)购自上海源叶生物科技有限公司。甲醇、乙腈购自德国默克制药与化工公司，磷酸为优级纯试剂，实验中所用水均为Milli-Q超纯水(18.2 MΩ·cm)。

1.1.2 主要培养基

LB培养基(牛肉膏1.5g、蛋白胨5g、NaCl 2.5g、超纯水500mL，土霉素剂量依实验所需添加)。固体LB培养基(牛肉膏1.5g、蛋白胨5g、NaCl 2.5g、琼脂9g、超纯水500mL，土霉素剂量依实验所需添加)。

筛选培养基((NH4)2SO42.0g，K2HPO40.05g，NaH2PO40.05g，琼脂20g，土霉素150mg/L，超纯水定容至1000mL，pH7.0～7.4)。无机盐培养基( (NH4)2SO42.0g，K2HPO40.05g，NaH2PO40.05g，超纯水定容至1000mL，pH调至7.0～7.4)。

1.2 方法

1.2.1 菌株的筛选

取10g筛菌原料于250mL三角瓶中，加入90mL超纯水，于150r/min，32℃条件下振荡30min。振荡后的样品静置5min后，吸取1mL上清液至LB培养基(土霉素浓度为25mg/L)中，培养5d后取1mL培养液至新的LB培养基(土霉素浓度为50mg/L)，依照此方法逐渐提高土霉素浓度(土霉素浓度依次为100mg/L，150mg/L，200mg/L)。最终于土霉素浓度为200mg/L培养基中吸取1mL培养液，依照梯度稀释法稀释至10-7，取10-7稀释液100μL涂布于筛选培养基，于37℃无菌环境下培养4d。取涂布得到的菌落，划线于新的筛选培养基平板上，重复多次，分离纯化至得到单一菌株。所得菌株于固体LB培养基斜面中保存。

1.2.2 菌株的鉴定

采用基因组提取试剂盒对菌株总DNA进行提取，以其为模板，采用通用引物27F和1492R对菌株16S rDNA进行扩增。PCR反应体系：基因组DNA 0.5μL，2×Pfu Mix 12.5μL，引物27F 1μL，引物1492R 1μL，用ddH2O 补足至25μL。PCR反应条件为94℃预变性5min，94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸2min，共30个循环；最后72℃延伸5min，4℃保温。将PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，得到条带单一、大小正确的产物后,将其送至上海生物工程有限公司进行测序，将所得16SrDNA序列与NCBI数据库进行同源度比对，使用MEGA 5.0 软件，采用Neighbor Joining 法构建系统发育树，自展值为1000。

1.2.3 分析测定方法

使用高效液相色谱仪(型号G1311B，美国安捷伦公司)测定土霉素含量。取培养液 3mL，吸取 6mL EDTA二钠-Mcllvaine 缓冲液，分别吸取1mL 正己烷，1mL 三氯甲烷，超声10min，5000r/min 离心10min，上清液经 0.45μm 微孔滤膜过滤，滤液用于 HPLC 分析。色谱条件为：色谱柱：ODS-2 HYPERSIL(250mm×4.6mm，5μm)不锈钢柱，流动相：乙腈:KH2PO4溶液(0.05mol/L)(20∶80，V/V)，检测器：紫外吸收检测器，检测波长：355nm，柱温：25℃，流速：1mL/min，每次进样量为 20μL(进样阀定量)，每个处理重复3次。

1.2.4 菌株生长曲线和降解性能测定

1.2.4.1 生长曲线测定

将纯化后的菌株接种到土霉素浓度为50mg/L无机盐培养基中，于37℃，转速150r/min的条件下连续培养10d，每间隔24h取2mL培养液，采用紫外分光光度计(型号UV1802G，天津冠泽科技)测定其在600nm的吸光度，使用OD600值来表示菌株的生长量，此过程去除土霉素悬浊液的背景值。

1.2.4.2 不同培养条件下菌株生长量和降解性能测定

将菌株接种于无机盐培养基中，在初始培养条件(温度37℃，pH7.0，接种量5%，转速150r/min)下，将底物浓度分别设置为10，25，50，100，150，200mg/L5个梯度，连续培养10d，测试菌株在相应条件下对土霉素的最高降解率和对应OD600值。每个处理均设置空白对照，且重复3次。然后，在确定最佳耐受底物浓度值的前提下，依次对温度(20，30，37，45，50℃5个梯度)、pH值(4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，6个梯度)、菌株接种量(1%，3%，5%，10%，20%5个梯度)和转速(0，70，100，140，200r/min5个梯度)条件进行考察，各参数测试过程采用上一步实验所获最佳条件值。降解过程均为培养箱避光培养。

2 结果与分析

2.1 菌株的筛选与鉴定

经过富集、初筛、复筛的驯化方式，分离出一株土霉素降解菌，将其命名为OTC-1，该菌能以土霉素作为唯一碳源进行生长繁殖。光学显微镜观察表明，OTC-1在培养基上的生长特征为表面光滑，向上凸起，较透明，粘韧性不等，有光亮色的圆形小菌落；经革兰氏染色后在1000倍油镜下观察得该菌呈红色米粒大小的短杆状，为革兰氏阴性菌。将得到的16SrDNA测序结果在NCBI上进行blast比对，结果表明OTC-1的16S rDNA序列与多种克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)具有高度相似性，相似度高达99%，初步判定OTC-1为肺炎克雷伯氏菌属。

2.2 OTC-1的生长曲线测定

在菌株连续培养的过程中，菌株生长的前24h，菌株OD600有小幅下降(图3)，由最开始的0.208降低至0.196，原因可能是该菌株接入含一定量土霉素的无机盐培养基后，首先进入短暂的迟缓期。24h之后，OD600值开始上升，并在第4～6d出现迅速上升趋势。培养第6d时OD600达到最大值0.594。这表明菌株在度过迟缓期之后能迅速进入对数生长期，与已知的相关研究结果相似。当培养时间超过6d时，菌株的生长量开始下降，在第6～7d时下降幅度较大。在试验过程中观察到随着时间的延长培养基的颜色发生变化，由黄色到红棕色再到紫褐色，这些颜色的变化可能是土霉素被菌利用后产生不同的中间代谢产物。有研究表明，抗生素降解过程的中间产物可能具有抑菌性，从而降低了微生物活性[8]。

2.3 不同培养条件对菌株生长及降解性能的影响

2.3.1 底物浓度对菌株生长的影响

图4所示为不同初始底物浓度对菌株生长的影响。由图可知，在初始土霉素浓度从10mg/L逐渐上升至200mg/L的过程中，菌株生长量呈现先上升后下降的趋势。在底物浓度为10mg/L上升至100mg/L过程中，菌株生长量随着底物浓度增加而保持上升趋势，但上升幅度较小，由0.227上升到0.419，仅上升了0.192。可能原因是本实验以土霉素为唯一碳源，并未添加其他碳源，而土霉素对菌株仍存在一定毒性，导致碳源不足以促使菌株快速繁殖[9]。当底物浓度从100mg/L增加至150mg/L时，菌株生长量出现大幅上升，并在150mg/L底物条件下OD600值达到最大值0.589。底物增大至200mg/L时，OD600值最大仅0.451，这表明菌株在底物浓度为200mg/L时大量死亡。即高浓度的土霉素对微生物的活性产生了强烈的抑制作用，影响到菌株的生长代谢，该结果与相关文献研究结果相似[10]。

2.3.2 温度对菌株生长和降解性能的影响

微生物对环境温度具有选择性，不同的温度条件通过调控微生物的产酶能力而间接影响到菌株的生长代谢及降解效能[11]。

实验结果(图5)表明，OTC-1有其最适生长的温度区间，不同的温度条件对其降解性能影响较大。在温度由20℃逐渐上升至37℃的过程中，菌株生长量以及菌株对土霉素的降解率都呈现出幅度较大的上升趋势，OD600值由20℃时的0.220上升达到最大值0.600，降解率由20℃时的16.66%增大至75.91%。在37～50℃梯度内，菌株生长量出现显著降低，这表明OTC-1是一种嗜中温细菌，能在温度适宜的条件下进行各项代谢活动，但超出其适宜温度时活性迅速降低。而降解率在37～50℃梯度内总体呈现下降趋势，在45～50℃时有些微上升，其原因可能是高温对四环素类抗生素的分解和水解具有促进作用[12]。

2.3.3 pH值对菌株生长和降解性能的影响

图6所示为初始pH值由4.0逐渐上升至9.0过程中菌株生长量以及菌株对土霉素降解率的变化。由图可知，当培养基pH值梯度在4.0～7.0时，菌株生长量及菌株对土霉素的降解率均随着pH的增加而上升，分别上升了0.270和64.68%，并在pH值为7.0时达到最大值0.501和78.01%。但菌株生长量与降解率的上升幅度并不一致，在pH值梯度为5.0～6.0时，OD600上升幅度明显不如降解率，这表明在酸性条件下pH值的小幅上升对菌株生长并无重大影响，却能较大限度地促进菌株降解土霉素。其原因可能是菌株的代谢产物偏碱性，在酸性条件下与氢离子结合，减轻了代谢产物对菌株的毒性[13]。而当pH值超过7.0继续上升时，菌株生长量和降解率均出现幅度一致的较大下降趋势。由此表明，过酸或过碱的条件对该菌株生长不利，在中性条件下，OTC-1可实现对土霉素的高效降解。

2.3.4 接种量对菌株生长量和降解率的影响

接种量的增加往往可以促进菌株种内协同作用，帮助其迅速适应环境，进而提高菌株的降解效率[10]。由图7可知，在接种量由1%上升至20%的过程中，菌株生长量与菌株对土霉素的降解率均呈现出先上升后小幅度下降的趋势，但菌株生长量与降解率的大幅上升区间并不完全一致。如图所示，在接种量由1%上升至10%的过程中，菌株生长量在1%～5%梯度上升幅度较小，而在5%～10%梯度内OD600迅速由0.200上升至最大值0.550，在10%～20%梯度呈现异常小幅下降。接种量的增加反而导致OD600值的下降，这表明当接种量达到10%后培养基内生物容纳量已经到达最大值。菌株对土霉素的降解率在1%～10%梯度内持续上升，但大幅度上升出现在3%～5%梯度，5%～10%梯度上升幅度远小于3%～5%梯度。这表明随着接种量的不断增加，接种量对菌株降解土霉素效率的影响逐渐减小，但在10%梯度以内仍存在积极影响。最终在接种量为10%时出现降解率最大值74.67%，接种量超过10%后降解率稍有下降。接种量取决于抗生素的种类、性质和菌的种类。利用能力强的菌自然接种量少，反之，利用能力弱的所需接种量就多。与现有筛菌研究对比，菌株OTC-1对土霉素的利用能力较弱[7]。

2.3.5 转速对菌株生长量和降解率的影响

转速的大小可表示溶解氧的多少，含氧量对菌株的生命活动起着至关重要的作用。图8所示为不同转速对菌株生长量和菌株对土霉素的降解率的变化。由图可知，在转速由0r/min增加至200r/min的过程中，菌株生长量和降解率均呈现先上升后下降的趋势，但上升和下降幅度并不相同。

转速由0r/min逐渐增加至140r/min的过程中，菌株生长量在0～100r/min梯度时上升幅度较小，仅上升了0.080，而在100～140r/min梯度时大幅上升，最终在140r/min时OD600达到最大值0.510。这表明OTC-1为需氧细菌，活性随着含氧量的增加而增强，随着转速逐步增加，高转速时的菌株生长量与降解率对比低转速时显著提升。140～ 200r/min梯度时菌株生长量下降0.060。其原因可能是转速过高使得剪切力加大，影响酶的活性，间接导致微生物的降解能力的下降。菌株对土霉素的降解率在0～100r/min梯度时上升幅度较大，增加了44.20%，而在100～140r/min呈现小幅上升，并在转速为140r/min时达到最大值76.73%。转速达到200r/min时，OD600值略有下降，但并未导致降解率的大幅下降，其原因可能是四环素类抗生素具有易被氧化的特性，溶解氧的增加可以在一定程度上促进土霉素的降解[14]。

3 讨论

污染物的生态环境效应是当今世界范围内广受关注的环境问题之一，抗生素残留所引发的生态安全问题具有持久性和隐蔽性。抗生素的问世直接促进了养殖业的迅速崛起，同时，由于对抗生素类药物的使用和管制不当，大量抗生素流入土壤和水体环境中。高浓度的抗生素不仅具有严重的生态毒性，同时导致大量耐性菌的产生[15]。由于养殖场的畜禽废弃物中土霉素浓度较高，不耐土霉素的细菌无法存活，故较易筛选出能有效降解土霉素的菌株。本实验筛选出一株土霉素高效降解菌，将其命名为OTC-1。

经初步鉴定，OTC-1为肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)。克雷伯氏菌是一种兼性厌氧的革兰氏阴性菌，当前在农业及环境污染物治理方面都有许多研究。有学者在2018年发现克雷伯氏菌具有降解四环素的能力，降解率可高达94.26%[16]；另有研究发现克雷伯氏菌在低氧环境下对菲具有降解能力[17]。本研究结果表明克雷伯氏菌在降解土霉素的过程中受温度和pH值影响较大，在最适温度(37℃)与中性pH值(7.0)条件下，菌株繁殖能力较强，对土霉素的降解性能最佳。Ngugen等人发现土霉素降解产物易损害生物的肝脏和肾脏，最终造成肝细胞的坏死，表明土霉素降解产物毒性可能较土霉素本身更严重，这与实验过程中菌株在生长曲线后期大量死亡的现象相呼应[18]。因此，进一步丰富土霉素降解菌的种库资源，积极探索无害降解土霉素和阐明土霉素的降解途径至关重要。

目前未有学者尝试利用克雷伯氏菌降解土霉素，本研究发现克雷伯氏菌对土霉素具有高效降解能力，丰富了土霉素降解菌的种类和数量。实验结果证明，菌株OTC-1在土霉素浓度150mg/L、温度37℃、pH值7.0、接种量10%和转速140r/min条件下，于无机盐培养基中培养10d后，对盐酸土霉素的降解率可达到76.73%。