抗重金属镉多克隆抗体的制备及纯化

王泽祥，孙晓林

（甘肃农业大学动物医学院，甘肃兰州730070）

随着人口的增长和城镇化、农业现代化的迅速发展，环境污染日益加剧，其中农产品的污染也逐渐增多，特别是动物性食品中的重金属污染现象越来越严重[1]。镉（Cd）是生物毒性最强的重金属之一，镉化合物经人体消化道吸收后不易排出或者分解，会在人体内长时间存留，对人体造成不同程度的危害，尤其对肝脏和肾脏造成严重的伤害[2,3]。哺乳动物长期摄入镉会导致排卵数目减少、卵细胞的受精能力和存活率降低、生育能力下降甚至不孕不育。此外，孕、产妇体内富集的镉化合物可通过胎盘进入胎儿的组织器官，亦可通过乳汁排出传播给婴儿，对胎儿和婴儿造成不同程度的损伤，如突变、致癌、致畸等[4-7]。鉴于动物性食品中的镉元素给人类健康所带来的巨大危害，建立高效、快速的重金属镉离子检测技术对保障食品安全和人类健康具有十分重要的意义。

近年来，动物性食品中重金属的检测技术和方法已得到了较大提升和改进，在原子吸收光谱法、原子荧光光谱法和比色法等传统检测方法的基础上，出现了电感耦合等离子质谱法、降级溶出伏安法等检测方法[5,7-9]。然而，这些方法并不能满足动物性食品中重金属快速检测、费用低和灵敏度高的要求。免疫学检测技术，如荧光偏振免疫技术、免疫胶体金快速层析技术、酶联免疫检测技术，是一类新的重金属离子检测技术，具有检测速度快、灵敏度高、费用低廉、操作方便等优势[5,9-15]。重金属离子酶联免疫检测技术（ELISA）的原理是通过将样品中的重金属离子与螯合物形成的复合物与包被在酶标板上的金属-螯合物-蛋白质复合抗原竞争抗体的抗原结合位点，再利用酶标记的二抗进行显色，与标准曲线对比得出重金属离子的含量[12,13]。

本研究运用重金属鳌合剂DTPA和镉离子制备重金属镉完全抗原，免疫新西兰大耳白兔，制备抗重金属镉离子的多克隆抗体，测定其效价，并进行纯化，为建立快速、灵敏、特异的镉离子ELISA检测技术奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试剂

DTPA螯合剂、二甲基亚砜（DMSO）和葡聚糖凝胶Sephadex G200均购自索莱宝科技有限公司；镉离子标准溶液、HEPES缓冲液、三乙胺、弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂购自西格玛奥德里奇（上海）有限公司；牛血清白蛋白（BSA）购自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 仪器与设备

pH计（瑞士梅特勒-托利多公司）、超纯水仪（美国Millipore公司）、磁力搅拌器（金坛市恒丰仪器厂）、冷冻离心机（湖南湘仪离心机仪器有限公司）、电泳仪（美国Bio-Rad公司）、紫外分光光度计（美国Plextech公司）、脱色摇床（海门市麒麟医用仪器厂）、超滤离心管（美国Millipore公司）。

1.3 实验动物

健康新西兰大耳白兔（2.0 kg左右）购于中国农业科学院兰州兽医研究所实验动物厂。

1.4 金属镉完全抗原的制备

重金属镉离子完全抗原的制备过程：称取50mg的DTPA溶于15mlDMSO中，在磁力搅拌器中缓慢溶解20 min，制备成金属螯合剂溶液；称取100 g牛血清白蛋白质（BSA），溶于HEPES缓冲溶液（10 mmol，pH 7.5）；将溶解的牛血清白蛋白溶液缓慢逐滴加入金属螯合剂溶液中，然后加入500μL三乙胺溶液，在磁力搅拌器中缓慢搅拌均匀后反应24 h；使用100 mmol/L EDTA和0.1 mol/L、pH=7.4 HEPES缓冲液预处理的超滤管4℃、6 000 rpm离心超滤15 min去除未偶联的DTPA；用pH 7.4的HEPES缓冲液洗取截留物，然后逐滴加入镉离子标准溶液500μL，反应4 h后，4℃、6 000 rpm离心超滤30 min除去未螯合的镉离子，再用pH 7.4的HEPES缓冲液稀释截留物，-80℃保存备用。

1.5 金属镉完全抗原的鉴定

完全抗原应用SDS-PAGE电泳鉴定，取BSA、DTPA-BSA、Cd-DTPA-BSA分别用三蒸水稀释到适当浓度，煮沸10 min，灌制12%浓缩胶和5%分离胶，加入电极缓冲液，每孔上样量10μL，Marker按说明书处理，设定电压为60 V，进行垂直SDS-PAGE电泳，电泳至溴酚蓝指示剂离底线1 cm时停止，考马斯亮蓝染色20～30 min，脱色至透明。

1.6 重金属镉完全抗原蛋白质质量浓度测定

运用紫外分光光度计测定重金属镉离子完全抗原中蛋白质的质量浓度。

1.7 重金属镉多克隆抗体的制备

取5只体重2 kg的雄性新西兰大耳白兔作为免疫动物，同时抽取免疫前的动物血清作为阴性对照。将制备好的免疫抗原0.5 mg与等体积的完全弗氏佐剂混合制成乳剂，采用皮下多点注射，完成初次免疫。4周之后，取0.5 mg免疫抗原与等体积不完全弗氏佐剂混匀，同法进行第二次免疫，此后每2周运用0.5 mg免疫抗原与等体积不完全弗氏佐剂免疫1次，于第五次免疫后1周心脏采血，分离血清，4℃保存备用。

1.8 多克隆抗体纯化纯度的测定

应用12% SDS-PAGE电泳检测抗体纯度，将SDS-PAGE电泳完成后的凝胶置于染色液中染色，之后放于脱色液中脱色，直至凝胶底色脱为无色，观察染色条带。

1.9 重金属镉多克隆抗体的纯化

取抗体血清运用Sephadex G-200凝胶柱层析法纯化多克隆抗体。具体步骤：第一，Sephadex G-200凝胶沸水浴5 h，冷却至室温后装柱，保证柱内无气泡且颗粒均匀。第二，用pH 7.4 PBS缓冲液平衡、洗脱。第三，收集不同峰时的抗体，装入透析袋，周围堆积PEG 6 000浓缩。浓缩后的多克隆抗体运用SDS-PAGE电泳检测纯度。

1.10 重金属镉多克隆抗体效价的测定

应用斑点ELISA法检测抗重金属镉多克隆抗体的效价，取硝酸纤维素膜（NC膜）修剪成4 cm见方的方格，应用0.1 mol/L、pH 7.4的磷酸盐缓冲液浸泡10 min，室温放置干燥后，将其用免疫抗原Cd-DTPA-BSA稀释液1μL包被，室温静置1 h；用50 g/L的脱脂乳37℃封闭1 h，然后用PBST洗涤3次，每次5 min；室温干燥后加入5μL梯度稀释一抗，同时设立阴性对照，置于37℃孵育1 h，然后用PBST洗涤3次，每次5 min；加入5μL 1:10 000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体，室温放置30 min后用PBST洗涤3次，每次5 min；每格加入适量DAB显色液，避光显色5～10 min，终止反应后，观察结果。

2 结果

2.1 重金属镉完全抗原Cd-DTPA-BSA的SDS-PAGE鉴定

通过蛋白质在SDS-PAGE中的迁移率来判断各种抗原的相对分子质量的变化。合成的DTPA-BSA和Cd-DTPA-BSA相对于BSA均存在滞后现象，表明二者分子质量均有增加，且Cd-DTPA-BSA相当于DTPA-BSA也有滞后现象，表明前者比后者分子质量增加更大，这与理论上抗原合成成功现象相符（见图1）。

2.2 免疫抗原的蛋白质浓度

运用紫外分光光度计法测定的蛋白质浓度为3.58 mg/ml。

2.3 SDS-PAGE电泳检测抗体的纯度

依据蛋白质分子Marker标记，运用凝胶柱层析法对制备的重金属镉多克隆抗体纯化后的纯度在80%以上（见图2）。

2.4 斑点ELISA测定抗重金属镉多克隆抗体效价结果

经观察，阳性反应为淡绿色斑点，斑点颜色随着抗体滴度的升高而变浅，兔抗重金属镉多克隆抗体的效价为1:1 600。

3 讨论

据统计，全球每年向环境中排放数万吨的重金属镉，其中有很大一部分流向土壤和水源，从而污染饮用水和农产品。因环境中的重金属降解非常缓慢，重金属镉会通过食物链进入家畜体内逐渐蓄积，从而污染动物性食品[5,14-16]。因此，快速灵敏的检测动物性食品中的重金属镉残留是保障食品安全和保护人类健康的重要措施。重金属免疫学检测技术已经逐渐发展成为动物性食品中重金属残留检测的主流技术，该技术以抗体技术为基础。重金属离子本身无免疫原性，需要先与重金属螯合剂形成复合物，通过载体如牛血清白蛋白（BSA）、鸡卵白蛋白（OVA）偶联复合物，从而形成完全抗原作为免疫抗原[9,17-18]。本研究应用双功能螯合剂DTPA、牛血清白蛋白（BSA）与重金属镉离子标准溶液制备重金属镉完全抗原Cd-DTPA-BSA,采用弗氏免疫佐剂免疫新西兰大耳白兔，大量制备抗重金属镉离子兔多克隆抗体，并应用凝胶柱层析法对制备的重金属镉多克隆抗体纯化。所获得的兔多克隆抗体效价较高，抗体纯化效果较好，为下一步重金属镉离子ELISA试剂盒的开发奠定了基础。