siRNA药物研发现状调研

王正明

摘  要：RNAi是近年来生命科学领域的重大发现，依据RNAi设计的siRNA药物被认为有着巨大的应用前景。国际上siRNA药物的研发炙手可热，国内该领域却几乎还是空白。文章通过对siRNA药物的原理、优缺点、研发现状，以及预计的应用领域进行了全面的调研，从而为国内该药物的研发提供资料支持。

关键词：siRNA药物;RNAi;研发调研

中图分类号：R91     文献标识码：A

Progress Investigation of siRNA Drug Research and Development

Wang Zhengming

（University of Cambridge，Cambridge， Cambridgeshire， England，CB2 1TN）

Abstract：RNAi is an important discovery in the field of life sciences in recent years，and siRNA drugs designed based on RNAi are considered to have huge application prospects. The research and development of siRNA drugs are hot in the world，but the field is almost blank in China. This paper has conducted a comprehensive investigation on the principles，advantages and disadvantages，research and development progress，and expected application areas of siRNA drugs，with a view to providing data support for the research and development of the drugs in China.

Key words：SiRNA drugs;RNAi;Research and development investigation

一、RNAi原理

1998年，美国科学家Andrew Fire和Craig Mello发现在线虫中双链RNA能够发挥特异的基因沉默作用[1]，并把该现象称作RNA干扰（RNA interfering，RNAi），两位科学家也因此获得2006年诺贝尔生理学或医学奖。

RNAi是细胞内调控基因表达的一种机制，主要的作用分子有三大类：小干扰RNA （small interfering RNA，siRNA），microRNA（miRNA），PIWI-interacting RNA（piRNA）。siRNA是一类长度在21—25个核苷酸的RNA分子，1999年英国科学家David Baulcombe在植物中首先发现[2]，它的前体为长的双链RNA，包括内源性的和外源性的。不同来源的双链RNA前体在细胞内被Dicer酶切割，形成短的双链RNA，其中的一条链会与Argonaute等蛋白形成基因沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC），根据碱基互补配对的原则，将与siRNA配对的靶mRNA切割或者抑制其翻译，从而阻止了靶蛋白的合成，起到基因沉默的效果[3]。miRNA也是一类能够调控基因表达的小RNA分子，与siRNA的不同之处主要在于前体，miRNA的前体是MIRNA基因的转录产物，它能够形成特定的茎环结构，从而被Dicer识别切割，而siRNA的前体是双链RNA，两条链是完全不同的来源和产生机制[3]。piRNA是一类长度在26—30个核苷酸的小RNA分子，其产生机制尚未清楚，被发现主要在维持动物生殖系细胞基因组的稳定性方面发挥作用[4]。

2001年德国科学家Thomas Tuschl首次发现，合成的siRNA转入Hela细胞后，能够引发特异性的基因沉默[5]，自此RNAi成了一种分子生物学实验手段，同时也被寄希望在生物医学研究与药物开发领域有更大的应用。

二、siRNA药物设计

Tuschl研究组发现外源导入siRNA能够引起基因沉默之后，2003年美国哈佛医学院的Judy Lieberman设计了针对Fas基因的siRNA药物，应用于小鼠模型，发现能预防小鼠感染暴发型肝炎[6]。然而siRNA药物用于治疗人类疾病还有很多问题需要解决。

（一）设计策略

基因沉默的效率取决于siRNA的效率，高效率的siRNA分子能达到超过RT-PCR检测极限的靶mRNA的抑制效果[7]。siRNA通常是长度为21—24个核苷酸的双链RNA，GC含量为30%—50%，3端有两个碱基的突出，每条链均为5磷酸与3羟基。设计siRNA药物时主要应考虑以下五点：

1.热稳定性

由于单链RNA极易被降解，因此siRNA的两条链必须形成稳定的配对，也就是要提高siRNA的热稳定性，以避免被迅速地降解。一般来说，双链siRNA不用经过任何化学修饰，本身即具有较高的热稳定性，但用2-氟核苷酸、2-氧甲基核苷酸、LNA等來代替普通核苷酸，能够进一步提高siRNA的热稳定性。

2.抵抗核酸酶

人体内的血清和细胞内都含有大量的核酸酶，能够降解RNA。为了抵抗核酸酶降解，需要对siRNA的碱基进行化学修饰，尤其对5和3末端的碱基进行化学修饰，能够显著提高siRNA对核酸酶的稳定性。

3.延长体内存在时间

未经修饰的siRNA进入体内约五分钟即被肝脏和肾脏清除[8]，多糖修饰、胆固醇修饰能够提高siRNA与血清蛋白的结合能力，从而延长siRNA在体内的半衰期，这样也就使siRNA进入靶组织的机会大大增加。

4.组织靶向特异性

如果药物能够靶向特异的组织，则药物的利用效率就会得以提高，同时药物对其他组织器官的副作用也会降低。siRNA药物组织靶向性问题目前可以通过以下两种手段来解决：一是局部给药，比如针对眼疾采用玻璃体注射，针对呼吸道疾病采用吸入的方式;二是将siRNA附着到能够结合到特定细胞表面的抗体或多肽上。

5.靶基因特异性

根据RNAi的原理，siRNA能够作用于所有与之互补配对的靶mRNA。siRNA结合到非预期的靶mRNA并抑制这些基因的表达，这种作用称作off-target，在siRNA药物临床应用时会引发严重的副作用。Off-target可以通过以下两个途径将其可能性降到最低：一是尽可能严谨地设计siRNA序列，减少与其他非靶基因的互补。由于人类的全基因组测序已经完成，因此可以将设计好的siRNA序列在整个基因组上预测其靶基因，看是否存在off-target的可能。二是通过某些化学修饰，可以使siRNA与靶mRNA的识别更为严格[9-10]。

（二）待解决的问题

1.给药方式

siRNA必须在体内被运送至细胞质内，才能进入RISC复合体，作用于靶基因的mRNA，从而发挥药效。不像线虫与果蝇细胞那样，大部分哺乳动物细胞都不能直接摄取siRNA。人体特定的器官系统，如呼吸系统、生殖系统、眼睛等，可以采用局部用药或者直接注射siRNA的给药方式。对于除此之外的其他器官系统，尚无临床上有效运送siRNA药物的方法。目前理论上的siRNA有效运送方式有以下几种：

将siRNA双链中的作用链的互补链共价交联胆固醇，使之通过细胞表面LDL受体介导进入细胞[11];在对小鼠的研究中，利用胆固醇共价交联的siRNA，作用于胆固醇转运蛋白ApoB，使小鼠血清胆固醇含量降低30%。

将siRNA结合到抗体-脯胺融合蛋白，使之通过细胞受体介导的方式进入细胞;这种策略有望实现更高级别的细胞特异靶向，Lieberman研究组发现，融合蛋白能将siRNA运送至HIV感染的淋巴细胞，而不进入未被感染的淋巴细胞[12]。

将siRNA包装进特定的脂质体或纳米颗粒，可以减少siRNA被吞噬细胞清除的概率，延长siRNA在循环系统中的时间。美国sRNA制药公司Sirna Therapeutics使用脂质体包装的siRNA，成功地将siRNA运送至小鼠肝脏，并且抑制了肝炎B病毒的复制[13]。

使用能够表达siRNA前体的病毒载体，但此手段出于安全性的考虑，很难适用于临床应用。

2.Off-Target

上文中已经阐述了siRNA的off-target现象，化学修饰可以帮助避免off-target。在内源的miRNA途径中，miRNA第二个核苷酸对于miRNA-靶mRNA相互作用至关重要。美国制药公司Rosetta Inpharmatics研究发现，对siRNA双链中的作用链第二个核苷酸进行化学修饰，能够抑制siRNA的off-target作用，而对其预期的对靶标的作用无明显影响[9]。

除了作用于非靶基因外，siRNA还可能通过干扰素途径或者Toll样受体途径，引发免疫反应。然而干扰素途径一般不会被短于30个核苷酸的双链RNA激活，并且在动物实验中，通过Real-time RT-PCR也未检测到有siRNA引起的干扰素反应。可能引起反应的Toll样受体主要是一些针对病毒双链RNA的受体，它们一般识别特异的序列，鉴于针对某个致病基因可以设计很多种siRNA，因此避免引起Toll样反应应该可以通过筛选解决。

3. 抗药性

在治疗病毒引起的疾病以及癌症时，由于病毒或者癌细胞复制时基因发生突变，使用siRNA药物有可能出现抗药性。由于siRNA药物通过序列互补配对发生作用，因此一旦靶基因发生突变，siRNA不能作用于其mRNA，致病基因的蛋白就会表达，siRNA药物将彻底失去药效。

对于可能的抗药性，理论上的解决方法是，设计针对靶基因保守区域的siRNA，此外，还可以使用多种siRNA靶向同一疾病的多个致病基因。如果还是无法解决抗药性，可能就需要根据产生抗药性后的突变靶基因序列，重新改变siRNA药物的序列。

4.干扰内源miRNA

siRNA药物还有一个可能的毒性，就是干扰细胞内源的miRNA。由于导入产生的siRNA前体和内源的miRNA前体需要经历相似的处理过程，因此对于关键的作用因子，比如Dicer，都会产生竞争，这也就限制了临床上siRNA的用药剂量。目前该方面尚无确切的实验数据。

三、国际国内siRNA药物研发现状

siRNA药物虽然理论上还有一些问题没有得到完全解决，但国外的制药巨头公司早已瞄准这个新药研发领域，希望研制出新的siRNA药物，对一些遗传疾病以及传染性疾病进行有效的治疗。2018年第一个也是迄今为止唯一的一个siRNA药物Onpattro获得美国食品药品管理局（FDA）批准上市，用于治疗遗传性甲状腺素介导的淀粉样变性引起的神经损伤。该疾病是由于病人体内一类淀粉样蛋白过度积累引起的，Onpattro通过抑制编码该蛋白基因的mRNA来达到治疗的目的。除此之外，siRNA药物研发的领军者——美國Alnylam公司正在研发针对肺移植过程中急性呼吸道合胞病毒感染的siRNA药物，针对AAT介导的肝脏疾病以及肝癌的siRNA药物，这些药物均处于不同的临床研究阶段。美国Quark制药公司也正在研发针对治疗脉络膜心血管形成导致的黄斑变性，以及心血管手术后的急性肾损伤等疾病的siRNA药物。可以看出，目前国际上siRNA药物的研发炙手可热。

在國内，siRNA药物已经被列入“十三五”生物产业发展规划的重点发展领域。苏州瑞博生物与美国Quark制药公司共同开发的QPI-1007，通过抑制促凋亡蛋白半胱天冬酶2基因，针对治疗非动脉炎性前部缺血性视神经病变，也已经进入临床实验阶段。该研究是国内进行的首个siRNA药物临床实验。

四、结论

RNAi在各种基因沉默现象中所起的巨大作用，预示着RNAi不但是研究基因功能的一种有力工具，而且为特异性基因治疗提供了新的技术手段，具有巨大的科研价值和社会经济价值。在基因药物的研制与开发方面，根据 21个寡核苷酸siRNA能够抑制同源mRNA的表达，人工设计合成外源性的21个寡核苷酸siRNA进行相关的遗传疾病及传染性疾病的药物治疗，治疗那些现有药物不能很好解决的疾病如SARS、艾滋病、各种肿瘤和遗传性疾病。尽管siRNA药物仍有问题尚未解决，但对于这些传统药物和手段无法治疗的疾病来说，它无疑是一道曙光，承载着人类征服这些疾病的可能。

“沉默”是金。或许不远的将来，国际生物制药领域将在基因沉默（RNAi）领域掘得第一桶金。理论上一切已经明确致病基因的疾病，都可以通过siRNA使之沉默，因此siRNA药物有着广阔的研究开发空间。国际上siRNA药物研发领域的竞争日趋激烈，国内这方面的工作才刚刚起步，我们要做的除了实验室研究，解决这些siRNA药物存在的问题之外，寻找可行的靶疾病自主进行siRNA药物研发也是十分必要的。

参考文献：

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[13]Morrissey D V，Lockridge J A，Shaw L，et al.Potent and persistent in vivo anti-HBV activity of chemically modified siRNAs[J]. Nature Biotechnology，2005（23）：1002-1007.