乌药对急性酒精性肝损伤模型大鼠肠道微生态的调节作用研究*

徐婵娣 谭明明 王军伟

天台县人民医院 浙江 天台 317200

酒精性肝病（ALD）是由长期大量饮酒引起的肝病，其发病率高、后果严重[1],已成为我国的第二大肝病[2]。现代研究发现[3]，乌药具有保护酒精性肝损伤、抑制炎症因子产生、降低门脉内毒素水平等作用，但具体的作用机制尚不十分明确，可能与调节肠道细菌微生态相关。本实验拟通过观察乌药对酒精性肝损伤大鼠肠道细菌群落结构及多样性的影响，初步探讨其对急性酒精性肝损伤大鼠肠道微生态的调节作用及机制。

1 材料和方法

1.1 方法：取健康雄性SD大鼠60只，随机分为6组，分别为正常对照组（Normal组）、模型对照组（Model组）、阳性对照组（PPC组）、乌药高剂量干预组（LGH组）、乌药中剂量干预组（LGM组）、乌药低剂量干预组（LGL组），每组10只。除Normal组灌服等体积的蒸馏水外，其余各组大鼠均给予酒精体积浓度为50%的白酒灌胃，灌胃容积为1ml/100g，每日1次，连续20天。自造模第l天起，Normal组和Model组给予等体积的蒸馏水灌胃，其余各给药组分别灌服相应的药物，灌胃容积为1ml/100g，每日1次，连续20天。PPC组的给药剂量为思密达0.6g/kg，LGH组、LGM组、LGL组的给药剂量分别为3g/kg、2g/kg、1g/kg。

1.2 标本处理：收集大鼠新鲜粪便（每组各取5份大便，每份2g），采用Bead-beating法从大鼠粪便中提取肠道菌群总DNA，予PCR扩增并纯化后在Illumina Miseq平台进行高通量测序及16S元基因组的生物信息学分析。末次给药后分别取腹主动脉血和肝门静脉血，检测血谷丙转氨酶、总胆红素、炎症因子、门静脉血内毒素水平；与Normal组相比，Model组大鼠血的各项检测指标显著升高，表明此次急性酒精性肝损伤模型大鼠造模成功。

1.3 统计学处理：用SPASS 20.0统计软件，计量资料以±s表示，组间比较采用两样本t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

1.4 MiSeq高通量测序结果分析处理：在97%相似度下用微生态定量分析流程（QIIME）软件将所测序列聚类为用于物种分类的操作分类单元（OTU），统计各个样本每个OTU的丰度信息。同时通过应用Mothur软件进行Alpha多样性分析。

2 结果

2.1 OTU分析结果：在本实验中采用QIIME软件将最终得到的有效序列聚类为OTU，来用于物种分类。通过OTU分析可以观察样本中不同微生物的丰度和多样性。统计各组在不同OTU中的丰度信息（每组计算各样本的OTU总数），同时对OTU按从门到种依次进行分类，结果见表1。由表1可知，LGM组的OTU数目最多，Model组、Normal组、PPC组的OTU较少，提示乌药各组大鼠肠道内有着较多的细菌种类。

表1 OTU数目和分类水平统计表

2.2 各组大鼠肠道细菌群落结构分析：对OTUs的代表序列进行物种注释后，比较各组在属水平上丰度排名前10的物种，见图1。图中显示，Model组大鼠肠道菌群各菌属中以普氏菌（Prevotella）比例最大，瘤胃球菌（Ruminococcus）、乳酸菌（Lactobacillus）等比例较小。与Model组比较，乌药各组及PPC组大鼠肠道中瘤胃球菌比例增加，普氏菌比例降低，差异具有统计学意义（P＜0.05），同时LGL组及PPC组的乳酸菌比例较Model组明显增加（P＜0.05）。

2.3 Alpha多样性分析：本实验是在97%相似度下，对单个样本进行Alpha多样性分析，通过Mothur软件来计算各样本细菌群落的物种丰度和多样性（见表2）。Shannon-Wiener曲线，利用各样本的测序量在不同测序数量时的Shannon指数构建的曲线。结果6组的Shannon-Wiener曲线均已达到平台期，说明该实验测序数据量足够大，几乎已获取了全部的微生物物种信息，可用来后续分析。Chao1和ACE是用来衡量群落丰度的指数，指数越大，说明群落丰富度越高。由表2可知，乌药各组及PPC组大鼠肠道菌群的Chao1和ACE指数均较Model组大，尤以LGL组的Chao1和ACE指数、LGH组的ACE指数最为显著，差异具有统计学意义（P＜0.05），提示LGL、LGH组大鼠肠道细菌群落的丰度较高。在细菌群落的多样性分析上，与Model组相比乌药各组及PPC组的Simpson、Shannon指数均较大，即多样性高，以LGL组最为明显，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

图1 比例最高的前10个属构成图

表2 各组Alpha多样性指数比较（xˉ±s）

3 讨论

中医学认为，乌药为理气药，对胃肠道功能有调节作用。本实验中发现乌药各组的OTU数目明显比Normal组多，提示了乌药对正常肠道微生态具有一定的调节作用，这与新近研究相符[4]。OTU分析结果显示，乌药各组的OTU数目较Model组及PPC组多，说明乌药可能增加酒精性肝损伤大鼠肠道微生物的种类，而且效果较思密达更优。对OTUs的代表序列进行物种注释后，比较各组在属水平上丰度排名前10的物种，发现Model组大鼠肠道菌群中乳酸菌、瘤胃球菌等比例相对较小，普氏菌比例明显增加，提示急性酒精性肝损伤时益生菌明显减少，有害细菌过度生长。与Model组、Normal组比较，LGH组、LGM组、LGL组及PPC组大鼠肠道中普氏菌比例降低，瘤胃球菌比例增加，以LGH组的作用最明显，同时发现LGL组及PPC组的乳酸菌比例较Model组、Normal组明显增加，差异具有统计学意义。这可能提示了普氏菌、瘤胃球菌对低剂量的乌药不敏感，而乳酸菌对低剂量的乌药较敏感。说明乌药有可能通过增加益生菌的量、抑制有害细菌的生长。

在Alpha多样性分析中，乌药各组大鼠肠道菌群的Chao1和ACE指数均较Model组大，说明了乌药各组大鼠肠道细菌群落的丰度较高；与Model组相比，乌药各组的Simpson、Shannon指数均较大，即多样性高，预示着乌药各组大鼠肠道中有着较多的细菌种类，细菌群落结构稳定。Model组多样性低，提示其肠道内细菌群落结构比较简单，可能存在相对单一的肠道优势细菌，结合各组在属水平上丰度排名，考虑为普氏菌过度生长。

本研究显示，乌药可通过提高大鼠肠道菌群的物种多样性，增加细菌群落结构稳定性，对酒精性肝损伤大鼠肠道微生物具有一定的调节作用。