大豆分离蛋白/纳米纤维素/阿魏酸复合膜的制备及其包装性能

李 彤，张 宏，赵晓彤，张英龙，张华江，夏 宁，刘纯哲，孙多文

（东北农业大学食品学院，黑龙江 哈尔滨 150030）

现如今由石油基聚合物制成的包装材料是污染生态环境的主要因素之一，与之相比，生物基聚合物制成的包装材料具有可再生、可生物降解的性质，因此近年来在世界范围内备受关注[1]。生物基聚合物包装可分为两类：天然基聚合物（如多糖、蛋白质）和化学基聚合物（如聚乳酸、聚己内酯）[2]。由于价格昂贵，化学基聚合物的使用受到了很大的限制。而天然基聚合物中以蛋白质为原料的包装材料得到了迅速发展，全球学者已针对多种蛋白质基的包装材料进行了研究，如大豆蛋白、玉米醇溶蛋白和小麦蛋白。

大豆蛋白膜由于其良好的生物相容性和生物降解性而具有很大的应用优势，但与传统食品包装相比，大豆蛋白膜的稳定性、阻隔性能和包装性能存在一定缺陷[3]。在近年来的相关研究中，研究者们采用改性大豆蛋白或添加其他天然、改性材料的方法，来提高大豆蛋白膜的相关性能，以弥补某些性能的缺陷。纳米纤维素是一种纤维素衍生物，具有高弹性模量、高抗张强度和高结晶度，且由于其低成本、低密度、可再生性、生物降解性和生物相容性而被广泛用作填充材料[4]。陈观福寿[5]将纳米纤维素与大豆分离蛋白（soy protein isolate，SPI）结合，使复合膜的透光性、机械强度等性能得到了提升。

阿魏酸是一种存在于植物中具有多种生物活性的酚酸衍生物，可以与蛋白质发生交联，因为其具有抗氧化和抗菌性，在日本被列为食品添加剂，美国也允许一些含有阿魏酸的制剂应用于食品当中[6]。沈凯青等[7]将阿魏酸添加到米渣蛋白中，使其具有更稳定的空间结构。包惠燕等[8]利用阿魏酸显著提高了SPI膜的阻气性和机械性能。Nuthong等[9]发现由阿魏酸形成的自由基可以与蛋白质中的酪氨酸或半胱氨酸残基反应，并且可以通过形成中间体来交联蛋白质和多糖。肖乃玉等[10]制备的阿魏酸-胶原蛋白膜具有很强的抑菌性，能有效地延长腊肠的货架期。

目前鲜有将纳米纤维素和阿魏酸结合来提高大豆蛋白膜性能的相关研究，本研究将三者结合，探究纳米纤维素和阿魏酸的添加量对膜机械性能、阻隔性、抑菌性（大肠杆菌和金黄色葡萄球菌）的影响，并对其进行微观表征，以制备出一种性能良好的大豆蛋白复合膜，为大豆蛋白膜的进一步研究提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

SPI（蛋白质量分数不低于90%） 山东省谷神生物技术有限公司；阿魏酸 河北省远成共创技术有限公司；纳米纤维素（水凝胶状，固体质量分数2.5%）广东省中山纳纤丝新材料有限公司；甘油（食品级）、氢氧化钠、氯化钙、氯化钾、亚油酸 天津市天大化工实验厂；氯化锂 天津市巴斯夫化工有限公司；醋酸钾、碳酸钾、溴化钠 天津市天力化学试剂有限公司；氯化镁 天津市东丽区天大化学试剂厂；碘化钾 天津市津北精细化工有限公司；氯化钠 天津市光复科技发展有限公司。

1.2 仪器与设备

AL204型电子分析天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；BS22025电子天平 德国Sartorius公司；测厚规（精度0.001 mm） 台州市艾测仪器有限公司；HP-50数显推拉力计测试机 乐清市艾德堡仪器有限公司；HH-4数显式电热恒温水浴锅、JJ-1精密增力电动搅拌器 常州国华电器有限公司；PHS-3C酸度计 上海康仪仪器有限公司；DHG-9240A型电热鼓风干燥箱 上海一恒科学仪器有限公司；UV-2600紫外分光光度计、X射线衍射（X-ray diffraction，XRD）分析仪、S-3400N扫描电子显微镜（scanning electron microscopy，SEM） 日本日立公司；OCA20型视频接触角测定仪 德国Dataphysics公司；Magna-4R 560傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）仪 美国Nicolet公司。

1.3 方法

1.3.1 复合膜的制备

精确称量10.0 g SPI、5.0 g甘油与300 mL蒸馏水混合于60 ℃水浴加热并搅拌1 h，以制成纯SPI膜成膜溶液，用浓度为1 mol/L NaOH溶液调节纯SPI膜成膜溶液的pH值至9.0。将纳米纤维素用磁力搅拌器搅拌30 min后备用，将不同量的纳米纤维素和阿魏酸加入到纯SPI膜成膜溶液中，在60 ℃下水浴加热并搅拌1 h，以制备不同组分的大豆蛋白复合膜成膜溶液（表1）。将成膜溶液倒置在硅胶板（长300 mm、宽240 mm、高12 mm）上，置于60 ℃的鼓风干燥箱中7 h，待冷却至室温后，将膜放置在相对湿度50%、（24±1）℃下回软后从硅橡胶板上剥离，本实验以纯SPI膜为空白组。

表 1 不同组分的大豆蛋白复合膜Table 1 SPI composite films with different compositions

通过预实验探究甘油对膜增塑效果的影响，向纯SPI膜成膜溶液中分别添加2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 g的甘油，结果表明添加5.0 g甘油对膜的增塑效果最佳，故本实验采用5.0 g甘油为增塑剂。

1.3.2 复合膜厚度的测定

参照王荟凌等[11]的方法，使用测厚规测量膜的厚度，在膜上随机选取10 个位置进行测量，取其平均值。

1.3.3 复合膜拉伸强度、断裂伸长率的测定

根据支雅雯等[12]的方法，使用数显推拉力计测试机在相对湿度50%、（24±1）℃条件下测量膜的拉伸强度。在测试前将膜裁成100 mm×15 mm的长条状，将其夹在两个探头之间，初始夹持间距为50 mm左右，十字头速率为15 mm/min，记录膜断裂时的最大作用力和拉伸前两探头之间膜的初始长度、膜断裂时的长度，按式（1）、（2）分别计算膜的拉伸强度和断裂伸长率。

式中：TS为膜的拉伸强度/MPa；F为膜断裂时的最大作用力/N；S为膜的横截面面积/mm2；EB为膜的断裂伸长率/%；L为膜断裂时的长度/mm；L0为膜的初始长度/mm。

1.3.4 复合膜透光率的测定

参照Han Yingying等[13]的方法，使用分光光度计测定膜的透光率。把膜裁成10 mm×100 mm的长条状，将其置于比色皿的一侧，测定600 nm波长处膜的吸光度（A），按式（3）计算膜的透光率。

1.3.5 复合膜水蒸气透过率的测定

根据支雅雯等[12]的方法，采用拟杯子法测定膜的水蒸气透过率，记录装有5.00 g无水氯化钙的锥形瓶质量，将裁成适当大小的膜覆盖在锥形瓶口，并用石蜡密封。将锥形瓶放置在含有饱和KCl溶液的真空干燥器中，直至锥形瓶的质量达到平衡后去除瓶口的膜后再次称质量，按式（4）计算膜的水蒸气透过率。

式中：WVP表示水蒸气透过率/（g·mm/（m2·d·kPa））；Δm表示水蒸气迁移量/g；L表示薄膜的厚度/mm；A表示薄膜的面积/m2；t表示测试时间/d；ΔP表示膜两侧的水蒸气压差/kPa。

1.3.6 复合膜氧气透过率的测定

参照郭宽等[14]的方法测量膜的氧气透过率，将膜置于含有1 mL亚油酸的锥形瓶口，并用石蜡密封。将锥形瓶置于（24±1）℃下，直至锥形瓶的质量达到平衡后去除瓶口的膜后再次称质量，按式（5）计算膜的氧气透过率。

1.3.7 复合膜吸湿曲线的测定

参照苏峻峰[15]的方法测定不同水分活度下膜的吸湿率。将膜裁成20 mm×20 mm的正方形，置于干燥器中48 h后称质量，将称质量后的膜置于含有不同饱和溶液的干燥器内（不同饱和溶液在25 ℃下的水分活度如表2所示），直至膜的质量达到平衡后再次称质量，按式（6）计算膜的吸湿率。

式中：MC为膜的吸湿率/%；m1为膜吸湿前的质量/g；m2为膜吸湿后的质量/g。

表 2 不同饱和溶液在25 ℃下的水分活度Table 2 Water activity of saturated solutions at 25 ℃

1.3.8 复合膜接触角的测定

参考支雅雯等[12]的方法，采用液滴法使用接触角测定仪测定膜的接触角，将膜裁成1 cm×2 cm大小置于测定仪上，测量范围0～180°，滴水量为0.5 μL。

1.3.9 复合膜抑菌效果的测定

参照Liu Yuanyuan等[16]的方法使用抑菌圈法测定膜的抑菌性能，把膜裁剪为直径为20.0 mm的圆状，将0.01 mL的大肠杆菌培养液（105～106CFU/mL）和0.01 mL的金黄色葡萄球菌培养液（105～106CFU/mL）分别均匀涂布在不同的培养皿中，将裁剪好的膜放置在干燥后的培养皿中，置于37 ℃的培养箱中24 h后，用尺测量抑菌圈的直径。

1.3.10 SEM观察复合膜的微观结构

《五子登科》寄托的是人们希望自家的孩子都能像窦禹钧的五个孩子一样，长大能获得科考成功，有美好前景的愿望。“五子登科”源于民间故事，说得是五代后周时期，燕山府有个叫窦禹钧的人，他的五个儿子都品学兼优，先后登科及第，故称“五子登科”。《三字经》也以“窦燕山，有义方，教五子，名俱扬”的句子称颂窦禹钧教育子女有方。

参照Mandal等[17]的方法，将干燥后的膜进行喷金处理后置于SEM下，观察其表面和横截面（表面放大倍数为3 000，横截面放大倍数为1 000）。

1.3.11 复合膜FTIR分析

使用FTIR仪在4 000～400 cm-1的波数范围内对干燥处理后的膜进行扫描，以4 cm-1的分辨率获得32 次扫描的平均值[17]。

1.3.12 复合膜XRD分析

将干燥后的膜置于XRD分析仪上进行分析，2θ的范围为5°～40°，放射源为Cu-Kα射线（λ＝0.154 nm），电压为40 kV，电流为150 mA，扫描速率为3（°）/min[17]。

1.4 数据统计与分析

采用SPSS 21.0软件进行数据统计分析，使用方差分析对数据进行差异显著性分析，使用Origin 8.0软件作图。所有数据均为3 次平行实验结果的平均值，结果以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 不同组分对大豆蛋白复合膜拉伸强度和断裂伸长率的影响

图 1 不同组分大豆蛋白复合膜的拉伸强度和断裂伸长率Fig. 1 Tensile strength and elongation at break of SPI composite films with different compositions

不同组分大豆蛋白复合膜的拉伸强度和断裂伸长率如图1所示，与空白组相比，A组和B组复合膜的拉伸强度显著增加，断裂伸长率显著降低（P＜0.05），纳米纤维素与蛋白质之间发生了键合和交联作用[18]，这种相互作用提高了复合膜的力学性能。与空白组相比，C组和D组复合膜的拉伸强度和断裂伸长率均显著下降（P＜0.05），实验表明添加0.2、0.4 g阿魏酸的复合膜成膜性较添加其他组分复合膜差。Steffensen等[19]提出，添加适量的阿魏酸能与蛋白质发生交联形成稳定的网络结构，但阿魏酸的含量过高，复合膜中则会出现游离的阿魏酸，从而导致复合膜的拉伸强度下降。而添加了阿魏酸和纳米纤维素的E组复合膜拉伸强度与空白组相比提高了116.19%，这不仅要归因于晶须的几何形状和刚性，还要归因于通过氢键连接的纤维素纳米粒子连续网络的形成[20]。而E组复合膜中添加的阿魏酸一部分与蛋白质发生交联，另一部分加强了纳米纤维素与蛋白质在复合膜中结合的相互作用，与此同时，这些相互作用的发生使分子间的距离缩小，形成了相对稳定的网络结构，使复合膜的柔韧性下降，从而降低了断裂伸长率[7]（与空白组相比下降了59.76%）。

2.2 不同组分对大豆蛋白复合膜水蒸气透过率和氧气透过率的影响

图 2 不同组分大豆蛋白复合膜的水蒸气透过率和氧气透过率Fig. 2 Water vapor permeability and oxygen permeability of SPI composite films with different compositions

不同组分大豆蛋白复合膜的水蒸气透过率和氧气透过率的变化情况如图2所示。空白组因其亲水性而具有较高的水蒸气透过率[21]，与之相比，添加纳米纤维素的A组和B组复合膜水蒸气透过率分别下降了10.36%和18.34%，这是由于纳米纤维素在蛋白质基质中分散，使水蒸气的扩散受到阻碍，氧气透过率的下降则是由于纳米纤维素与蛋白质之间形成了致密的薄膜网络结构[13]。添加阿魏酸的C组和D组复合膜的水蒸气透过率与空白组相比下降了49.55%和65.22%，这是由于阿魏酸与蛋白质之间发生了交联，结构更加致密，有效地阻碍了水蒸气在复合膜中的扩散。E组复合膜的水蒸气透过率下降幅度更加显著（P＜0.05），与空白组相比下降了90.91%，这是由于氢键和自由基之间的交联增加[22]，提高了复合膜网状结构致密性。而复合膜的氧气透过率变化规律与水蒸气透过率相同，E组复合膜的氧气透过率与空白组相比下降了77.55%，这同样也是分子间结构变化所导致的结果。

2.3 不同组分对大豆蛋白复合膜吸湿率的影响

不同组分大豆蛋白复合膜在不同水分活度下的等温吸湿曲线如图3所示，随着水分活度的增加，各组复合膜的吸湿率均呈现上升趋势。在相同的水分活度条件下，添加了10、20 g纳米纤维素的复合膜（A组和B组）与空白组相比，吸湿率略微降低，这是由于纳米纤维素分子间以及纳米纤维素分子与蛋白质分子之间的氢键相互作用以及纳米颗粒在该水平上的良好分散[20]。添加了0.2 g阿魏酸的复合膜（C组）增长幅度与B组相近，当水分活度大于0.6时，才呈现出明显差异。

图 3 不同组分大豆蛋白复合膜的吸湿曲线Fig. 3 Moisture absorption curves of SPI composite films with different compositions

添加了纳米纤维素和阿魏酸的复合膜（E组）吸湿率最低，阿魏酸与蛋白质分子发生交联，使亲水基团暴露减少，纳米纤维素分子与蛋白质分子之间相互作用也得到增强，分子间距离减小，故而吸湿率较其他组复合膜相比有所降低。根据Cassini等[23]的研究结果，GAB模型可以较好地模拟天然生物材料的吸湿规律（水分活度小于0.9时），GAB模型如式（7）[15]所示。

式中：EMC为复合膜的平衡水分吸收率/%；Wm为单层水分子的饱和吸收率/%；C为Guggenheim常数；k为与多分子层吸附性能相关的因子；aw为水分活度。

表 3 不同组分大豆蛋白复合膜的GAB拟合参数及均方根误差Table 3 GAB model constants and root mean square errors of SPI composite films with different compositions

表3为不同组分大豆蛋白复合膜GAB模型的拟合参数（Wm、C、k）和决定系数（R2），决定系数反映了吸湿数据与GAB模型的拟合程度。由表3可知，复合膜吸湿曲线的拟合程度均大于99.00%，证实各组复合膜的吸湿数据与GAB模型具有良好的拟合程度。由单层水分子的饱和吸收率（Wm）可知，纳米纤维素和阿魏酸共同添加到复合膜中时，由于分子间的相互作用，蛋白质的亲水基团分别与纳米纤维素分子、阿魏酸结合，减少了水分子与亲水基团结合的位点，从而导致了复合膜的单分子吸附能力大大降低。

2.4 不同组分对大豆蛋白复合膜透光率和接触角的影响

透光率是评估复合膜包装性的重要指标。由表4中A组和B组复合膜结果可知，随着纳米纤维素含量的增加，复合膜的透光率显著增加（P＜0.05），说明了纳米纤维素对透光率具有显著影响，纳米纤维素和SPI具有很好的相容性[13]。而由C组和D组复合膜结果可知，阿魏酸的添加会导致复合膜透光率显著降低（P＜0.05），这与阿魏酸与蛋白质发生的交联作用有关[24]。E组复合膜的透光率低于空白组，但高于C组和D组，这与阿魏酸对纳米纤维素与蛋白质之间结合有加强作用相关。

表 4 不同组分大豆蛋白复合膜的透光率及接触角Table 4 Transmittance and contact angle of SPI composite films with different compositions

接触角是评估复合膜水敏感性的重要指标，当接触角小于90°时，表明复合膜表面亲水，当接触角大于90°时，表明复合膜表面疏水[25]，即接触角越大，复合膜的疏水性越强。由表4可知，纳米纤维素的添加对复合膜的疏水性能影响很小，而阿魏酸对复合膜的疏水性能有明显的增强作用，C组和D组复合膜的接触角较空白组相比分别增长了93.58%和99.34%，阿魏酸与蛋白质分子交联，使蛋白质分子亲水基团的暴露减少，从而增强了疏水性。E组复合膜的接触角较空白组增长了127.21%，其原因与吸湿率降低的原因相同。

2.5 不同组分对大豆蛋白复合膜抑菌效果的影响

图 4 不同组分大豆蛋白复合膜的抑菌圈直径Fig. 4 Inhibitory zone diameters of SPI composite films with different compositions

图4为6 组不同大豆蛋白复合膜对大肠杆菌（G-）和金黄色葡萄球菌（G+）的抑菌效果，用抑菌圈直径（复合膜直径为20.0 mm）反映。空白组、A组和B组复合膜对两种菌株的抑菌圈直径均为20.0 mm，说明SPI和纳米纤维素对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌没有抑制作用，而添加了阿魏酸的C组、D组复合膜对大肠杆菌的抑菌圈直径平均值分别为25.4 mm和33.5 mm，对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径平均值分别为28.3 mm和38.1 mm，说明随着阿魏酸含量的增加，复合膜对两种菌株的抑菌圈直径均显著增加（P＜0.05），这不仅证实了阿魏酸的抑菌作用，同时也说明了阿魏酸的添加量对复合膜的抑菌性有显著影响，此结果与肖乃玉等[10]的研究结果一致。阿魏酸对两种菌株的抑制效果存在显著差异（P＜0.05），添加阿魏酸后的复合膜在金黄色葡萄球菌中的抑菌圈直径显著大于在大肠杆菌中的抑菌圈直径（P＜0.05），说明阿魏酸对金黄色葡萄球菌的抑制作用大于对大肠杆菌的抑制作用，此结论与李次力[26]的研究结果一致。阿魏酸对菌株的抑制作用与其亲脂的特性相关，因此对不同菌株的抑制程度有所不同[27]。E组与D组复合膜对两种菌株的抑制作用差异不显著（P＞0.05），也证实了纳米纤维素对两种菌株没有抑制作用。

2.6 不同组分大豆蛋白复合膜的SEM观察结果

图 5 不同组分大豆蛋白复合膜的表面和横截面SEM图Fig. 5 Surface and cross-sectional SEM images of SPI composite films with different compositions

由图5可知，空白组的横截面存在许多不均匀的孔隙，而A组和B组复合膜的孔隙则在添加纳米纤维素之后有所减少，这种现象是由于纳米尺寸的纳米纤维素较好地分散在SPI分子中，并且SPI和纳米纤维素之间具有良好的相容性[20]。当添加阿魏酸时（C组和D组），复合膜表面出现不同程度的褶皱，横截面没有出现孔隙，这与阿魏酸的含量有关，阿魏酸含量偏高不仅会使复合膜内存在游离的阿魏酸，还会使蛋白质发生自聚集，这与Kang Haijiao等[28]的研究结果相似。E组的表面较光滑，无聚集现象的产生，横截面无孔隙，较为平整，这印证了E组复合膜的机械性能最优的原因。

2.7 不同组分大豆蛋白复合膜的FTIR分析结果

图 6 不同组分大豆蛋白复合膜的FTIR图Fig. 6 FTIR spectra of SPI composite films with different compositions

图6 显示了不同组分大豆蛋白复合膜在4 000～400 cm-1范围内的FTIR图。空白组分别在1 629、1 536 cm-1和1 235 cm-1处显示其酰胺I带（C＝O伸缩振动）、酰胺II带（N-H弯曲振动）以及酰胺III带（N-H和C-N伸展弯曲）[13]。而位于3 274 cm-1处的峰归因于O-H和N-H的弯曲振动，2 925cm-1处的峰归因于-CH2的伸缩振动[29]。随着纳米纤维素的加入，空白组光谱中3 274 cm-1处的吸收峰移动到B、C组复合膜的3 270 cm-1处，这表明SPI的氨基和纳米纤维素的羟基之间发生了少量的分子键合[30]。添加阿魏酸后的C组和D组复合膜分别在1 523 cm-1和1 522 cm-1处出现新的肩峰，表明复合膜中的氢键数量增加，这同时证实了阿魏酸与蛋白质的交联作用[31]。添加了纳米纤维素和阿魏酸的E组复合膜在1 521 cm-1处出现新肩峰，且峰高比C组和D组出现的肩峰高，表明氢键数量的大幅度增加，证实了阿魏酸对纳米纤维素与蛋白质之间的作用力有增强作用，该结果也解释了D组复合膜阻隔性能较好的原因。

2.8 不同组分大豆蛋白复合膜的XRD分析结果

图 7 不同组分大豆蛋白复合膜的XRD图Fig. 7 X-ray diffraction analysis of SPI composite films with different compositions

通过对XRD图（图7）分析可以观察到不同组分大豆蛋白复合膜的晶体结构和相容性，复合膜在2θ＝10.2°、19.5°处的两个宽衍峰分别对应复合膜的二级结构α-螺旋和β-折叠[18]。由于7S和11S无定形球蛋白，空白组在19.5°处出现一个无定型峰，A、B、C和D组复合膜在19.5°处的峰值强度明显低于空白组，这说明纳米纤维素和阿魏酸分别添加到复合膜中后，均使复合膜的结晶度降低。A组和B组复合膜结晶度的降低是由于纳米纤维素增加了分子结构的无序性，而C组和D组复合膜结晶度的降低是由于阿魏酸的交联破坏了蛋白质分子的规则排列，从而改变了其结晶结构[32]。E组复合膜在19.5°处的峰值强度高于空白组，这说明纳米纤维素和阿魏酸同时添加到复合膜中，可使复合膜的结晶度升高，这意味着分子链的排列变得紧密，其原因是阿魏酸与纳米纤维素、蛋白质发生了共价交联，使得分子间距离减小，导致大豆蛋白复合膜二级结构的变化[7]，这同时也是复合膜机械性能、阻隔性能变化的原因。

3 结 论

本实验制备了不同组分的大豆蛋白复合膜，研究了纳米纤维素和阿魏酸的添加对其机械性、阻隔性和抑菌性的影响，并通过SEM、FTIR和XRD图对其进行微观结构表征，探究其性能变化的原因。结果表明：与纯SPI膜相比，添加纳米纤维素20.0 g、阿魏酸0.4 g后的复合膜，其拉伸强度、接触角均显著提高，吸湿性也得到提高，而断裂伸长率、水蒸气透过率、氧气透过率和透光率均显著下降。阿魏酸的添加使复合膜分子结构中的氢键数量增加，这是由于阿魏酸与纳米纤维素和蛋白质之间发生了共价交联，减少了蛋白质的亲水基团暴露，使之形成了相对稳定的网络结构。这样制备的大豆蛋白复合膜的机械性、阻隔性大大提升，且表面光滑、截面平整，并对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有一定的抑菌性。