体外产气法研究百脉根及其缩合单宁对瘤胃发酵特性及降解率的影响

沈思聪 罗佳璇 魏元浩 李志威 黄倩倩

（扬州大学动物科学与技术学院，江苏扬州225000）

近年来，为了提高动物生产效率、改善动物健康和减少畜牧生产对环境的负面影响，植物提取物作为饲料添加剂在畜牧生产中的应用成为了研究热点之一。但是，植物提取物在实际生产应用中存在含量少、提取工艺复杂、提取率低、产品纯度差以及价格昂贵等问题。许多优质牧草中含有丰富的活性物质，在反刍动物生产中可直接饲喂富含活性物质的优质牧草来解决这一问题。

百脉根（Lotus corniculatus L.）是一种富含缩合单宁的多年生豆科牧草，在我国南北地区均有栽培。其叶量丰富、产量高，尤其是其茎秆细软，适口性和营养价值均优于其他豆科牧草。而且，百脉根的生态适应性强，尤其是对肥力差、pH值较低或排水不良等贫瘠土壤的适应能力要强于苜蓿等大多数豆科牧草。因此，在我国南方尤其是高温多雨、苜蓿易烂根的平原地区，适宜推广种植[1]。单宁是植物体内一类复杂的次生代谢产物，根据化学结构的不同通常分为水解单宁、缩合单宁和间苯酚单宁三大类。单宁由于其适口性较差，易与蛋白质、糖类和金属离子等结合成难以消化吸收的复合物，降低动物的采食量和营养物质的消化率，长期以来一直被认为是饲料中的抗营养因子。随着研究的不断深入，发现日粮中含有适量的单宁不仅可以提高反刍动物蛋白质利用率[2]、有效预防瘤胃臌胀病[3]和提高动物生产性能[4]，还可以减少反刍动物胃肠道寄生虫病的发生[5]和减少甲烷的排放[6]，降低绵羊粪中大肠杆菌O157∶H7 的排泄量[7]。单宁对反刍动物的营养作用取决于其摄入量和化学结构[8]，而单宁在植物体内的含量和化学结构受植物种类、种植环境、生长阶段和贮藏方法等因素的影响[9]。因此，在研究单宁在动物生产中利用时要充分考虑这些因素。

国外研究表明饲喂百脉根可以提高绵羊小肠内氨基酸的利用率[2]、提高羊毛产量[10]和增加羊奶产量及改善奶品质[11]，这些与其体内的缩合单宁有关。但目前国内有关百脉根在畜牧生产中的应用研究较少。因此，本研究拟采用体外发酵系统评估百脉根对瘤胃发酵特性和消化率的影响，并通过添加聚乙二醇（PEG）的方法确定其体内含有的缩合单宁在瘤胃发酵过程中的作用，为我国百脉根在畜牧生产中的开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用的百脉根和燕麦干草均来自扬州大学实验农牧场。百脉根在盛花期进行收获，105 ℃杀青10 min，然后65 ℃烘干。烘干后的百脉根和燕麦干草粉碎过1 mm筛，密封备用。

体外发酵所用瘤胃液采集自3 头扬州大学实验农牧场的带有永久性瘤胃瘘管的绵羊。试验当天在晨饲前采集瘤胃内容物，经4 层无菌纱布过滤后置于保温瓶中，迅速带回实验室进行试验。

1.2 试验设计

试验采用单因素设计，设置六组处理，分别为燕麦（O 组）、燕麦和百脉根混合（OL 组，干物质比例为1∶1）、百脉根（L组）、燕麦+聚乙二醇（PEG）（OP组）、燕麦干草和百脉根+聚乙二醇（OLP组）、百脉根+聚乙二醇（LP 组），作为发酵底物。聚乙二醇的作用是与单宁特异性结合，消除单宁的活性，聚乙二醇与单宁的比例为2∶1时可以完全结合单宁[12]。

1.3 体外发酵培养

参照Menke 等[13]的方法配制人工瘤胃缓冲液，通入CO2至无色，预热至39 ℃，与采集过滤后的瘤胃液以2∶1的比例混合均匀。称取0.5 g发酵底物装入滤袋内（ANKOM 公司，USA）置于150 ml 培养瓶中，每组3 个重复，同时做3个空白对照，向每个发酵瓶中加入60 ml 混合人工瘤胃培养液，并向瓶中立即通入CO2后将培养瓶置于39 ℃的恒温振荡水浴锅中培养。分别于0、1、2、4、6、8、10、12、24、48、72 h快速取出测量瓶内气压，计算产气量。培养72 h后，取出置于冰上终止发酵。装有残渣的滤袋洗涤烘干后称重，发酵液转移至50 ml离心管中，测pH值后于-80 ℃保存。

1.4 测定指标与方法

产气量（ml/g）=（不同时间点记录的各瓶产气量-该时间点空白瓶的产气量）/发酵底物重量

瘤胃干物质降解率(DMD，%)=[（发酵前底物重-发酵后残渣重）/发酵前底物重]×100

采用冯宗慈等[14]比色法测定氨氮浓度。使用氯化铵作为标准品，在700 nm条件下进行比色。

采用日本岛津GC-14B 气相色谱法测定挥发性脂肪酸含量。

1.5 数据分析

本试验采集的所有数据先由Excel 2007 软件进行整理，再利用SAS 9.4 的Mix 模型对所有指标进行方差分析，采用LSD 法进行多重比较。显著水平为P＜0.05。

2 结果

2.1 体外产气量

图1 燕麦、燕麦百脉根混合物、百脉根及添加PEG的瘤胃产气量

从图1 可以看出，随着发酵时间的延长，各处理组的产气量呈增长趋势。从4 h 开始，各处理组产气量出现显著性差异，48 h 后趋于一致。在4～24 h 之间，L 组产气量显著低于O 组（P＜0.05），从8 h 开始，OL 组逐渐向O 组产气量接近（P＞0.05）。在6～24 h之间，LP 组产气量显著低于OP 组（P＜0.05），在6～12 h，OLP 组产气量位于OP 组和LP 组之间（P＞0.05），12 h后趋于向OP组接近（P＞0.05）。在8～24 h之间，L组显著高于LP组产气量（P＜0.05）。

2.2 瘤胃干物质降解率（DMD）

图2 燕麦、燕麦百脉根混合物、百脉根及添加PEG的瘤胃干物质降解率

从图2 可以看出，L 组的DMD 与OL 组差异不显著(P=0.072)，两者均显著高于O组（P＜0.05）。LP组的DMD 在所有组中最高(P＜0.05),但与L 组无显著差异（P=0.18）。O 组和OP 组，OL 组和OLP 组之间均没有显著差异（P＞0.05）。

2.3 瘤胃发酵性能

混合瘤胃培养液的初始pH 值为6.86，经过72 h的培养后，各组发酵底物的pH 值在6.16～6.27 之间（表1）。其中，L 组的pH 值显著高于O、OL、OLP、OP组（P＜0.05），但与LP 组之间无显著差异（P＞0.05）。LP组的pH值显著高于OLP组，但与其他组差异不显著（P＞0.05）。O、OL、OLP、OP 组之间pH 值无显著差异（P＞0.05）。

表1 燕麦、燕麦百脉根混合物、百脉根及添加PEG的瘤胃发酵参数

各组瘤胃液的氨态氮（NH3-N）浓度无显著差异（P=0.27）。L 组和OL 组瘤胃液的总挥发性脂肪酸浓度显著高于O 组（P＜0.05）。OP 组总挥发性脂肪酸浓度显著高于O 组（P＜0.05），L 组和LP、OL 组和OLP 组之间无显著差异（P＞0.05）。所有处理组中乙酸的比例最大，其次是丙酸，丁酸占7%～8%左右。其中OL组和L组瘤胃液的乙酸比例明显高于O组瘤胃液（P＜0.05），添加PEG三组瘤胃液的乙酸比例为LP组＞OLP组＞OP 组。L 组和LP 组乙酸比例没有明显差异（P＞0.05），O 组的乙酸比例显著高于OP 组（P＜0.05），OL组的乙酸比例显著高于OLP组。O、OL组和L组的丙酸和丁酸比例均没有显著差异（P＞0.05），LP组丙酸比例显著低于OP 组和OLP 组（P＜0.05），但丁酸比例显著高于其他两组（P＜0.05）。OL组和OLP、L组和LP组的丙酸和丁酸比例无显著差异（P＞0.05）。O组戊酸和己酸的比例均在所有组中最高。O组和L组瘤胃液异丁酸比例显著高于OL组（P＜0.05），L组异丁酸比例显著高于LP 组（P＜0.05）。O、OL 组和L 组三组的乙酸/丙酸值没有显著性差异（P＞0.05），但LP 组的乙酸/丙酸值显著高于OP组和OLP组（P＜0.05）。O、OL组和L组三组与相应的PEG组之间的乙酸/丙酸值也没有显著性差异（P＞0.05）。

3 讨论

产气量作为体外发酵体系中评定反刍动物瘤胃微生物发酵的重要指标，综合性地反映了发酵底物的可发酵程度，表明了瘤胃微生物发酵活动的总趋势，是反映发酵底物可利用性的综合指标之一[15]。在本试验中，虽然48 h和72 h两个时间点的产气量各处理组之间没有差异，但是在4～24 h和6～24 h之间，百脉根组和百脉根燕麦混合组的产气量明显低于燕麦组，说明日粮中添加百脉根可以降低瘤胃发酵的产气量。这可能与百脉根和燕麦的营养组成相关，百脉根是豆科牧草，相比与禾本科燕麦，可溶性碳水化合物含量低，而蛋白质含量高。研究发现，饲料中糖（可发酵纤维）的产气量要高于蛋白质的产气量，饲料的可发酵有机物含量越多，瘤胃微生物的活性越高，产气量就越大[16-17]。与本试验结果类似，李龙瑞等[18]报道了在稻草秸秆中添加不同比例的百脉根，随着发酵底物中百脉根比例的增加，产气量降低，并推测是与百脉根所含的单宁有关。本研究通过在发酵底物中添加聚乙二醇来明确百脉根中单宁的作用。本研究发现在8～24 h，添加聚乙二醇后的百脉根产气量降低，百脉根燕麦混合组也表现出这种趋势，这表明百脉根中的单宁促进了瘤胃发酵产气。王慧玲等[19]利用Syringe 体外培养体系研究单宁酸对绵羊瘤胃发酵的影响，发现单宁酸提高了24 h体外产气量。这些研究表明单宁对瘤胃整体微生物活性没有影响，并对瘤胃发酵有一定的促进作用，但机理尚不清楚。今后需要更多的研究来阐明百脉根单宁对瘤胃发酵产气的作用。

干物质是饲料营养价值的基础，也是决定干物质采食量（dry matter intake，DMI）的重要组成部分，反映饲料整体可消化的难易程度。Cheema 等[20]研究发现，干物质瘤胃降解率与日粮中蛋白质水平呈正相关。本试验中，百脉根组的干物质降解率明显高于燕麦组，可能与百脉根含有较高的粗蛋白有关，这表明百脉根比燕麦更易被反刍动物消化。添加聚乙二醇的百脉根组和未添加组的干物质降解率没有明显差别，表明百脉根单宁对瘤胃干物质降解率没有影响。一般来说，摄入缩合单宁含量超过5%干物质时会影响饲料的适口性，降低采食量和消化率，从而影响动物的生产性能，单宁含量低于5%干物质则没有影响[21-22]。本试验所采用百脉根干草的缩合单宁含量为2.9%，与前人研究结果一致。

维持瘤胃内稳定的微生态环境是保证瘤胃微生物正常生长及发挥正常功能的必要条件。瘤胃pH 值是评价瘤胃内环境的一个重要指标，影响瘤胃pH 值的因素有很多，包括饲粮组成、动物的采食速度和反刍次数、瘤胃微生物区系的变化及瘤胃的VFA 浓度。本试验各处理组瘤胃液的pH 值在6.16～6.27，处于瘤胃发酵的正常生理范围内。百脉根组的瘤胃液pH 值高于燕麦组,而添加聚乙二醇的百脉根组和未添加组没有差异，表明百脉根单宁对瘤胃内环境没有影响。

氨氮（NH3-N）浓度是反映瘤胃氮代谢的重要参数，与饲粮蛋白质或NPN 降解速率、瘤胃内微生物利用氨的能力等因素密切相关。李大彪等[23]研究发现饲粮单宁添加量达到6%时降低了瘤胃液氨氮的浓度。李龙瑞等[18]研究发现稻草中添加百脉根降低了体外发酵瘤胃液氨氮的浓度。但本试验结果表明百脉根和燕麦的瘤胃氨氮浓度没有差异，所含单宁也对氨氮浓度没有影响。这可能与百脉根单宁活性不同有关。单宁来源、植物的种植环境均会影响单宁的活性[9]。

在反刍动物瘤胃中，饲料碳水化合物被微生物发酵的主要产物是挥发性脂肪酸（VFA），其能为动物机体活动提供能量，并维持瘤胃功能[24]。 VFA是碳链为1～6的脂肪酸，主要为乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、异丁酸、异戊酸，其中乙酸、丙酸和丁酸占据了挥发性脂肪酸的95%以上，所以在研究VFA时主要讨论这三种酸的变化。百脉根组的总VFA 含量和乙酸浓度明显高于燕麦组，表明百脉根在为反刍动物提供能量这方面的营养价值优于燕麦。添加聚乙二醇没有影响百脉根的VFA模式，这表明百脉根中的单宁对瘤胃挥发性脂肪酸没有影响。

4 结论

与燕麦相比，百脉根瘤胃体外发酵的产气量较低，瘤胃干物质降解率和瘤胃液总挥发性脂肪酸含量较高。百脉根所含缩合单宁对瘤胃产气有促进作用，对其他瘤胃发酵特性没有影响。结果表明百脉根的营养价值优于燕麦，百脉根单宁对瘤胃发酵性能影响较小。未来需要更多研究来探讨我国不同地区种植的百脉根中单宁的含量和化学结构与其活性的关系，进而明确百脉根单宁在反刍动物生产中的营养作用。