抗纤丸治疗肝纤维化的网络药理学研究

王 晶，樊亚东，王立新，王 丽*

（1.天津市第二人民医院，天津 300192； 2.天津中医药大学，天津 301617）

抗纤丸是天津市第二人民医院院内制剂，由血府逐瘀汤加减化裁而来，具有活血化瘀和扶正祛邪之功，临床用于治疗慢性活动性肝炎、肝纤维化及肝硬化已近50年。自上世纪90年代开始，课题组经过多年的药理和临床研究证实［1，2］，抗纤丸具有减轻肝细胞炎症反应、调节相关细胞因子、降解各型胶原基质等多种抗肝纤维化的作用，药用价值和安全性较为肯定。

肝纤维化是指由各种致病因子所致肝内结缔组织异常增生，导致肝脏中细胞外基质的过度积累，纤维性瘢痕形成的病理过程。早期肝纤维化经过及时干预治疗，可减缓或防止进展为肝硬化甚至肝癌［3］。目前大量研究表明：相较于化学药物，中药具有多靶点、多途径、

多层次的药理作用优势，能够整体系统地抑制肝纤维化的进展［4］。中药复方抗纤丸成分复杂，针对其治疗肝纤维化的活性成分、作用靶点和作用途径仍不明确，尚待深入。网络药理学基于网络生物学和多向药理学，尤其适合揭示中医药的复杂作用机制。本研究通过网络药理学方法，初步探索和阐述抗纤丸治疗肝纤维化的药理学机制，为其在临床的使用提供理论依据，为进一步的药物研发提供思路。

1 材料与方法

1.1 网站数据库和分析软件 中药分子作用机制网络分析工具（Batman-TCM）（http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/） 数据库；OMIM 疾病数据库（http：//www.omim.org）；Drugbank 数据库（https://www.Drugbank.ca/）；Uniport数据库（https://www.uniprot.org/）；STRING 数据库（https://string-db.org）；网络图像可视化软件Cytosca pe3.4.0软件（https://cytoscape.org/）;Metascape网络分析平台（metascape.org/gp/index）；BioGPS数据库（http://biogps.org/）；Genecards数据库（https://www.genecards.org/）。

1.2 方法

1.2.1 抗纤丸化学成分与靶点挖掘 通过Batman-TCM数据库挖掘抗纤丸（当归、川芎、赤芍、鳖甲、川楝子、黄芩、太子参、白花蛇舌草、黄芪、五味子、冬虫夏草和甘草）单味中药的化学成分。设置化合物靶点预测的阈值（score cutoff＞20）筛选抗纤丸单味药的潜在蛋白靶点。

1.2.2 肝纤维化相关靶点获取 以“hepatic fibrosis”和“liver fibrosis”为检索词，分别通过OMIM和Drugbank数据库获取肝纤维化相关靶点。使用Uniport数据库，限定物种为人，对蛋白进行名称规范转化操作。

1.2.3 蛋白质相互作用网络的构建及关键靶点筛选将“1.2.1”和“1.2.2”项中得到的靶点进行比对，筛选重复靶点，并导入STRING数据库，选择物种为“Homo sapiens”，构建蛋白相互作用网络。选取分值＞0.9分的高置信度区间，并根据自由度值（一个节点在蛋白互作网络中与该点直接作用的节点的数目，自由度越大则其参与的生物功能越多）筛选关键靶点。

1.2.4 抗纤丸中药-成分-疾病靶点网络构建 将抗纤丸单味药、化合物成分、关键作用靶点信息导入Cytoscape 3.4.0软件绘制中药-成分、成分-疾病靶点网络图。采用Merge功能最终建立中药-成分-疾病靶点网络。

1.2.5 基因功能与通路分析 为进一步研究抗纤丸治疗肝纤维化的作用情况，使用Metascape平台对肝纤维化和抗纤丸相关靶点进行总体分析。将抗纤丸治疗肝纤维化的关键作用靶点，进行KEGG代谢通路富集分析和GO生物过程富集分析。同时将关键作用靶点分别导入BioGPS和Genecards数据库中获得组织分布和亚细胞分布相关信息，并作网络构建。

2 结果

2.1 抗纤丸作用化合物及靶点 检索数据库得到抗纤丸化合物及相关靶点数，见表1。删除重复数据，获得抗纤丸作用化合物共577个，涉及相关作用靶点1 788个。

2.2 肝纤维化相关靶点 在OMIM和Drugbank数据库中分别找到肝纤维化相关靶点536和297个，去除重复基因，共得到632个疾病靶点。

2.3 蛋白质相互作用网络的构建及关键靶点筛选 将抗纤丸作用靶点与肝纤维化靶点进行比较，查找抗纤丸治疗疾病的作用靶点共计194个。为筛选出关键作用靶点，将194个蛋白导入SERING平台进行蛋白互作网络可视化，见图1。根据自由度筛选得到55个关键作用靶点，见表2。

表1 抗纤丸化合物成分和靶点情况

表2 55个关键作用靶点自由度

图1 抗纤丸作用靶点蛋白互作关系

2.4 构建抗纤丸中药-成分-疾病靶点网络 将抗纤丸12味中药、涉及的213个化合物成分和55个关键靶点信息导入Cytoscape软件绘制中药-成分、成分-疾病靶点网络图。采用Merge功能合并网络，对单味中药、成分和靶点进行标识。如图2所示，共涉及280个节点和564条边。节点表示单味中药、成分和疾病靶点，边表示三者彼此间的关联。其中六边形节点表示单味中药，三角形节点表示化合物成分，圆形节点表示关键靶点。

图2 抗纤丸中药-成分-疾病靶点网络图

2.5 基因功能与通路分析 将1 788个抗纤丸治疗相关靶点和632个肝纤维化相关靶点分别导入Metascape平台，使用最新版本数据库（最后更新时间为2019-09-14）转化为相应的H.sapiens种类的基因。外圈大半圆为抗纤丸治疗相关靶点，外圈小半圆为肝纤维化靶点。内圈用深色的连线将两者重叠的基因进行连接，并用内圈深色部分标识，浅色曲线连接属于同一丰富本体术语的基因，见图3。使用KEGG pathway、GO Biological Processes、Reactome gene Sets、Canonical Pathways、CORUM对55个关键作用靶点进行通路富集分析。对排名前20名的通路途径进行展示，“靶点数”表示提供的列表中具有参与特定通路的基因数量；P值由累积超几何分布计算而得，P值越小，表示这个通路中富集的差异基因越多，“Log10（P）”是log以10为底的值。“Log10（q）”是log以10为底的多测试调整后的P值，结果见表3。结果显示:抗纤丸治疗肝纤维化可能与活性氧代谢过程调控、炎症反应调控、转移酶活性正调控、脂质代谢过程调控、平滑肌细胞增殖的调控和胶质细胞再生等密切相关。

图3 抗纤丸和肝纤维化相关靶点重叠概况

表3 抗纤丸治疗肝纤维化相关靶点富集通路

2.6 关键作用靶点组织分布和亚细胞分布 将55个抗纤丸治疗肝纤维化的关键作用靶点导入BioGPS数据库，获得其组织分布信息。为保证结果的可靠性，值保留每个基因表达量较高的前5位组织，将组织分布信息导入Cytoscape软件构建组织-靶点网络，结果见图4-A。其中菱形节点表示组织，节点表示度值大小，V型节点表示靶点。结果显示，关键作用靶点主要分布于肝脏（liver，度值=33）、心肌细胞（cardiac myocytes,度值=18）、心脏（heart，度值=16）、全血（whole blood，度值=13）、CD56+自然杀伤细胞和胚胎肝（CD56+NK cells、fetal liver，度值=12）、CD33+髓细胞、CD14+单核细胞、平滑肌、CD34+细胞 （CD33+myeloid、CD14+monocytes、smooth muscle、CD34+，度值=10）、脂肪组织（adipocyte，度值=8）。此外，众多免疫细胞和免疫器官如：BDCA4+树突细胞、CD8+T细胞、721 B淋巴细胞和CD19+B细胞也在治疗中发挥一定作用。这些结果能够为抗纤丸治疗作用的药理学分子研究提供指导。将上述55个关键作用靶点导入Genecards数据库，获取和保留confidence大于5的各靶点亚细胞分布信息。采用Cytoscape软件构建亚细胞-靶点网络，结果见图4-B。其中圆形节点代表靶点，三角形节点代表亚细胞结构。结果显示，靶点更多分布于细胞膜（plasma membrane，度值=29）、细胞外基质（extracellular，度值=27）、细胞核（nucleus，度值=20）、细胞基质（cytosol，度值=15）。此外，结果也提示高尔基体、内质网、核内体、细胞骨架、线粒体以及溶酶体可能为药物作用的重要细胞结构。

图4 抗纤丸关键作用靶点组织分布（A）关键作用靶点亚细胞分布（B）图

3 讨论

中医学无肝纤维化病名记载，根据其病理变化和临床表现，可归属于“胁痛”、“积聚”范畴。基本病机为正虚邪盛，邪毒久积，气滞血瘀，肝络受损，依据病患体质可出现不同临床表现。肝纤维化本质是“虚损生积”，肝脏性质损伤，阴精亏损，无以化气，导致气血不行，血凝成积［5，6］。根据中医传统理论，抗纤丸方中当归、川芎、赤芍活血化瘀，鳖甲滋阴软坚共为君；黄芪扶正益气，冬虫夏草益肺肾补精髓，五味子收敛固涩益气生津，太子参健脾生津四者共为臣；川楝子疏肝通络为佐；黄芩、白花蛇舌草清热解毒，甘草调和诸药为使；十二味中药调理肝脾肾三脏，活血化瘀，软坚散结以达益气扶正祛邪之功效。

活化的肝星状细胞（hepatic stellate cell,HSC）是生成纤维组织的关键细胞，在肝纤维化的发生发展中起关键作用。不同病因刺激造成肝脏慢性损伤,肝细胞凋亡、坏死或坏死性凋亡,导致肝脏炎症。肝细胞、肝窦内皮细胞、Kupffer细胞和淋巴细胞可通过释放细胞内容物、细胞因子和活性氧簇等，刺激静止的肝星状细胞活化，导致肝脏细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的过度增生与沉积，形成肝窦和纤维间隔的毛细血管化，并伴有间隔内的血管增生，最终发生肝纤维化［7］。目前治疗肝纤维化的主要策略主要有：治疗原发病、改善肝实质细胞损伤与凋亡、调节ECM合成与降解、干细胞移植和基因治疗等［8］。

网络分析显示：抗纤丸可能通过调控氧化应激（GO:2000377）、肝脏炎症反应（GO:0040017、GO：0050900、GO：0050727、GO：0001816、GO:0045785）、脂质代谢（GO：0062012、GO：0019216、GO:1905952、GO：0048660、GO：0042063）发挥治疗肝纤维化的作用。临床和实验研究表明［3］，氧化应激通过产生活性氧ROS介导纤维化进展。DNA、蛋白质和脂质氧化破坏诱导肝细胞坏死及凋亡，放大炎症反应，促使纤维化发生。肝脏的慢性炎症包括：白细胞的浸润和巨噬细胞的活化等，诱导肝细胞的坏死和凋亡，坏死的肝细胞刺激Kupffer细胞分泌炎症介质，直接启动HSC的激活［9］。而HSC的激活又可促进自然杀伤细胞、T细胞、树突细胞、巨噬细胞和内皮细胞的表达，形成炎症和纤维化之间的恶性循环，促进纤维化进展［10］。川芎的主要活性成分川芎嗪可抑制HSC增殖，促进其凋亡，通过参与Hedgehog通路发挥抗纤维化作用［11］。此外川芎嗪还可通过NLRP3炎症小体途径减轻炎症，抑制HSC中炎症细胞因子表达［12，13］。鳖甲提取物可通过TGF-β1/Smad NF-κB信号通路抑制 HSC 激活［14］。

脂肪细胞因子由脂肪组织分泌，其中瘦素是循环脂肪形成激素，具有促进纤维发生的作用。而脂联素作为血浆中最丰富的脂肪因子，其表达与AMPK和PPARγ调控有关，对肝脏具有一定的保护作用［3］。五味子提取物联苯双酯可调控HSC中PPARγ表达，抑制细胞增殖，促进其凋亡［15］。脂联素可促进基质金属蛋白酶的活化，进而发挥抗纤维化的作用。当归、川芎等药材的水溶性提取物阿魏酸钠可通过调控基质金属蛋白酶，抑制胶原分泌，控制肝纤维化发展［16］。

中药黄芩中的黄酮类化合物黄芩苷可抑制脂类代谢、炎症和纤维化的关键调节因子，发挥抗纤维化的作用［17］。

抗纤丸治疗的关键组织靶点多分布于肝脏（胚胎肝）、心脏（心肌细胞）、血液、平滑肌、脂肪组织以及相关免疫细胞，包括CD56+自然杀伤细胞、CD33+髓细胞、CD14+单核细胞、CD34+细胞、BDCA4+树突细胞、CD8+T细胞、721 B淋巴细胞和CD19+B细胞等。这些结果与抗纤丸可能发挥抗炎、改善血液循环、抗氧化、调节脂质代谢等生物学功能的基础相符。亚细胞分布研究表明55个关键作用靶点倾向分布于细胞膜上，其中高尔基体、内质网、核内体、细胞骨架、线粒体以及溶酶体可能为药物作用的重要细胞结构。这些组织分布和亚细胞结构的梳理研究，为抗纤丸治疗肝纤维化的药理学分子研究提供指导。

综上所述，本研究采用网络药理学方法揭示抗纤丸治疗肝纤维化的多靶点、多通路的复杂机制。结果显示抗纤丸可能通过调控氧化应激、肝脏炎症反应和脂质代谢，发挥重要的治疗作用。拓宽了抗纤丸在治疗肝纤维化方面的视角，也为中药复方治疗肝纤维化提供了机制研究方面的思路。