山东省牛传染性鼻气管炎流行病学调查

文│白明月（山东省禹城市畜牧业发展中心）

牛传染性鼻气管炎（Infectious Bovine Rhinotracheitis，IBR）又称红鼻病，是由牛传染性鼻气管炎病毒（Infectious Bovine Rhinotracheitis Virus，IBRV）引起的一种主要发生在牛的传染病，主要特征是高热、流鼻液，随后发展为呼吸困难等症状，除导致牛生长缓慢、产奶量下降外，亦可造成繁殖力下降、流产等，同时IBRV还可引起免疫抑制，继发其他呼吸道病原，给各国养牛业造成较大的经济损失。虽然IBR发病后死亡率不高，但由于其可影响国际贸易，世界动物卫生组织（OIE）将其列为法定报告的传染病，我国也将其列为二类动物疫病。该病最早于1955年由Miller在美国科罗拉多的育肥牛群中发现，并于1956年由Madin首次分离出病毒，之后一些学者相继在发病牛的眼结膜、脑、外阴、流产胎儿等组织、材料中分离出病毒，1964年Huck确认IBRV为疱疹病毒。我国于1980年由周泰冲在新西兰进口奶牛中首次分离到IBRV，之后流行病学调查显示IBR在我国广泛流行，严重制约我国养牛业的健康发展。

表1 选取牛场相关信息

一、材料与方法

1.材料。

（1）病毒、细胞与血清。IBRV阳性毒株由山东省农业科学院奶牛研究中心研究员杨宏军馈赠，牛胚肾细胞（MDBK）、IBR阳性血清、阴性血清均购于中国兽医微生物菌种保藏管理中心（CVCC），待检血清采集自山东省济南、泰安、德州、东营、潍坊、临沂等6市共15个奶牛场或奶牛养殖小区，共计1981份样品。上述牛场未暴发过IBR且均未接种包含IBRV抗原的疫苗。

（2）试验动物。2～6月龄健康奶牛筛选自泰安市及周边养殖场，要求IBRV抗原、抗体均为阴性。IBRV抗原检测时取待检牛的鼻拭子，浸泡于1.0毫升含10%胎牛血清的细胞培养液中，低温运送至实验室，反复冻融3次，8000r/min（r/min指每分钟所旋转的圈数）离心10分钟，取上清液抽提DNA后直接PCR检测；IBRV抗体检测时无菌采血，析出血清后使用IBRV ELISA抗体检测试剂盒［Infectious Bovine Rhinotracheitis Virus（BHV-1） gB Antibody Test Kit］进行检测。

表2 不同牛场犊牛ELISA法检测抗体阳性率汇总（2016—2018年）

表3 不同牛场成年牛ELISA法检测抗体阳性率汇总（2016—2018年）

表4 不同地区ELISA法检测抗体平均阳性率汇总（2016—2018年）

（3）主要试剂及仪器。IBRV ELISA抗体检测试剂盒为IDEXX公司产品。2×Taq Plus MasterMix（Dye）购于康为世纪生物科技有限公司；低熔点琼脂糖、中性红染色液均为索莱宝公司产品；胎牛血清为Biological Industries（BI）公司产品。

2.试验方法。

（1）山东省牛传染性鼻气管炎流行病学调查。为了解山东省内IBR的感染情况，本课题组在2016—2018年，连同地方畜牧兽医局的春防秋防工作，选取济南、泰安、德州、东营、潍坊、临沂等6市15个奶牛场开展流行病学调查，分别对15个牛场中2～6月龄犊牛和1岁以上成年牛（包括怀孕牛）进行采血，犊牛采血方式为颈静脉采血，成年牛通过尾根静脉采血，共计采血1981份，其中犊牛采血489份，成年牛采血1492份。操作时使用10毫升注射器无菌采血5.0毫升，之后将血液负吸到促凝管中，混匀后静置，置于4℃析出血清后收集到EP管中，56℃水浴30分钟进行灭活，-20℃保存待用。15个牛场相关信息如表1。

（2）ELISA法检测血清样品。按说明书进行操作，具体如下：

试验前准备。将试剂盒所有组分恢复至18～26℃，并混匀；洗涤液的准备：对恢复至18～26℃的洗涤液进行10倍稀释；取出用抗原包被的反应板，并记录好样品位置；每孔加入50微升稀释的洗涤液；分别将50微升的阴性对照加入到适当的2个孔中，分别将50微升的阳性对照加入到适当的2个孔中，分别将50微升的被检样品加入到剩下的检测孔中；将反应板中的溶液振荡混匀；37℃条件下孵育2小时；弃掉孔内液体，用大约300毫升洗涤液洗涤加样孔，共洗涤5次。每次洗涤后弃去孔内液体，最后1次洗涤后将孔内残留的洗涤液排干；在每个反应孔中加入100微升酶标抗体；在18～26℃条件下孵育1小时；弃掉孔内液体，用大约300毫升洗涤液洗涤加样孔，共洗涤5次。最后1次洗涤后将孔内残留的洗涤液排干；在每个反应孔中加入100微升的TMB底物溶液；在18～26℃条件下避光孵育10分钟；在每个反应孔中加入100微升的终止液终止反应；在450纳米波长下测定样品及阳性、阴性对照的吸光值。

酶标仪读数后进行计算，当阻断率＜45%时，判为样品阴性；当45%≤阻断率 ＜55%时，判为可疑；当阻断率≥55时，判为样品阳性。

二、结果与分析

山东省牛传染性鼻气管炎流行病学调查的结果。将采集的1981份血清样品全部使用试剂盒进行检测，结果显示，济南等6市15个牛场中有14个牛场检测出IBRV gB抗体阳性牛（表2、表3）。其中，济南、泰安、德州、东营、潍坊、临沂等6市试验牛场的IBRV gB抗体整体平均阳性率分别为10.2%、58.0%、12.4%、20.3%、18.5%和5.0%（表4）。通过数据分析可知，山东省的牛场普遍感染IBRV，但不同牛场的检测结果差异较大，有些牛场，如TA1，犊牛与成年牛抗体检出率都很高，而牛场DZ4的IBRV gB抗体检出率则为0。试验结果显示，不同牛场犊牛、成年牛的抗体检出率并无明显相关性。

三、讨论

1.不同牛场IBRV抗体存在差异的原因。经检测可知，不同牛场IBRV抗体阳性率存在较大差异，部分牛场则未检出，原因之一在于不同牛场采取的管理措施不同，如牛场TA1，未实行自繁自养的模式，主要从东北、内蒙古和浙江等地引牛，犊牛的流动性较大，在引牛的过程中不清楚当地牛场疫病、免疫等情况，加之长途运输，可能导致牛感染IBRV或是IBRV隐形感染，之后配种产犊，由于病毒垂直传播的特性，导致新生犊牛也存在IBRV抗体。反观牛场DZ4，实行自繁自养，近3年中均未检出IBRV抗体阳性牛，说明牛场的管理方式对于疫病的防控会起到关键作用。

2.犊牛与成年牛抗体关系的分析。对于自繁自养的牛场，如济南市的3个牛场，牛场DZ5、DY2等，新生犊牛全部来源于牛场的怀孕牛，犊牛出生后需饲喂初乳，如果怀孕牛曾经感染过IBRV，体内会产生相应的抗体，并随着初乳被犊牛吸收。初乳在犊牛体内的生物半衰期只有3周左右，但9月龄也能检测到，同时考虑到IBRV垂直传播的特性，体内有IBRV抗体的怀孕牛产犊后的犊牛IBRV抗体检测应为阳性。本研究采集的犊牛与成年牛样品虽然只有部分为母子关系，但抗体阳性率整体符合规律，即怀孕牛IBRV抗体阳性牛产犊后犊牛IBRV抗体也为阳性。而另外部分的牛场，由于经常引进、卖出犊牛，加之引进的犊牛背景不清楚，部分犊牛育成后会配种产犊，导致犊牛与成年牛之间没有明显的IBRV抗体相关性。

四、结论

流行病学调查结果显示，山东省的牛场普遍感染IBRV，抗体阳性率为5%～58%，不同牛场检测结果差异较大，不同牛场犊牛、成年牛的抗体检出率并无明显相关性。