桂参通脉胶囊对心衰大鼠心室重构MMP-1及TIMP-1的表达研究

赵中秋，高琪，梁君昭，刘畅，徐洋，刘鑫，谭毅

(1.陕西中医药大学，陕西 咸阳 712046；2.西安市中医医院，陕西 西安 710021)

慢性心力衰竭(CHF)是一种由多种因素引发的心脏结构和功能异常的疾病，是心血管疾病发生和发展的终末期，临床表现为患者心脏排血量不足、充盈能力低下、全身组织器官灌注不足等症状。众多患者深受其扰，有研究证实，欧洲5亿人口中患有CHF有200万～1 000万之多，且4年生存率仅为50%，在我国，以心力衰竭为因的死亡人数较过去40年增加了6倍。而美国大约有500万患者，且每年新增的心衰患者超过55万之多[1-2]。

近年来对该病的研究逐步深入，目前其治疗方案多以利尿强心扩管为主，需长期口服相关药物，不仅治疗费用昂贵，而且现代药物的毒副作用也不可忽视，如抗心律失常药物最易引起心律失常，常用药物阿托品，其药理作用多，甚者易出现中枢不良反应，某些治疗心衰的药物如PDEs、Ca2+通道阻滞剂等，实际上可能对心衰弊大于利。

中医药治疗该病疗效确切，毒副作用较小，特别是中医药针对心力衰竭发展的不同阶段的辨证施治，充分体现了中医药治疗该病的独特优势。为此，笔者在中医药理论指导下，结合西安市中医医院长期临床实践经验，参照现代药理研究成果，将桂枝、党参、茯苓、葛根、郁金等药物在严格的药房制剂规范下制成具有补气益心、活血通脉、化痰祛浊的桂参通脉胶囊。该制剂经过临床前期药效实验表明，对胸痹之心气亏虚、心悸乏力、心肌缺血、心律失常等心血管疾病效果确切。

慢性心力衰竭(CHF)主要的病理改变是心室重塑，究其原因，应与交感神经系统、RAAS系统、基质金属蛋白酶(MMPs)、基质金属蛋白酶抑制酶(TIMPs)等的平衡失调与紊乱有关。因此，稳定MMPs与TIMPs平衡，延缓心室重构，减慢心衰进度，是治疗慢性心衰的路径之一。在前期临床研究的基础上，笔者初步假设,桂参通脉胶囊防治心衰的机理可能与调控神经内分泌、改善血流动力学有关，从而抑制神经体液机制，阻断RAAS系统，阻止和延缓心室重构，达到减少心衰复发、延缓病程、延长生存期的目的。因此，本研究主要通过应用桂参通脉胶囊干预心衰大鼠模型，从MMP-1及TIMP-1的角度探讨桂参通脉胶囊对心室重构的影响。

1 资料与方法

1.1 药物与试剂

桂参通脉胶囊由西安市中医医院提供，规格：0.45 g×36粒；卡托普利，12.5 mg/粒(湖南汉森制药股份有限公司，批号：H43021388)；0.9%氯化钠注射液；肝素钠注射液；注射用盐酸阿霉素(盐酸多柔比星)；MMP-1、TIMP-1抗体。

1.2 动物分组

选取雄性SD大鼠60只，体质量200～250 g。按照随机数字表随机将其分为正常对照组、心衰模型组和桂参通脉低、中、高剂量组及卡托普利组，每组各10只。除正常对照组外，其余大鼠以腹腔注射盐酸阿霉素(ADR)造模。

1.3 造模方法

注射用盐酸阿霉素加入灭菌注射用水5 mL使之溶解，后加置0.9%生理盐水中，配成每1 mL生理盐水含盐酸阿霉素0.8 mg的溶液。除正常对照组外，其余分别在第1、3、5周大鼠腹腔注射盐酸阿霉素溶液3 mg/kg，在第2、4、6周腹腔注射盐酸阿霉素溶液2 mg/kg，每周1次，共注射6次，每只大鼠累积用量为15 mg/kg。正常对照组同时腹腔注射等容积的生理盐水。造模成功的指标为：造模组大鼠表现萎靡不振，进食、活动量减少，体质量、体温明显下降，心功能测定其舒张期心脏左室内压变化最大速率及心率值均明显低于正常组。

1.4 给药方法

桂参通脉低、中、高剂量组分别给予0.034 g/(kg·d)、0.068 g/(kg·d)和0.135 g/(kg·d)桂参通脉胶囊，卡托普利组给予6.75 mg/(kg·d)卡托普利，空白对照组和心衰模型组给予同体积蒸馏水灌胃，连续给药4周。

1.5 观察指标

于小鼠心脏左室前壁处取一定重量的心肌组织，采用蛋白免疫印记法(Western blot)测定MMP-1、TIMP-1的活性，用凝胶成像系统量化分析各组间MMP-1、TIMP-1吸光度。

1.6 统计学处理

2 结果

结果显示，MMP-1在心衰模型组的表达程度显著升高，通过桂参通脉胶囊干预后发现，中、高剂量组可显著降低MMP-1蛋白表达，且明显低于卡托普利组(P>0.05);与心衰模型组相比，卡托普利组、桂参通脉中、高剂量组分别是其0.77倍、0.56倍、0.54倍。TIMP-1的蛋白在正常对照组表达最高，心衰组表达最低，通过桂参通脉胶囊干预后发现，卡托普利组、桂参通脉中、高剂量组均明显上调，其中以桂参通脉高剂量组上调明显(P<0.05)。结果见表1和图1～图4。

表1 各组大鼠血清MMP-1和TIMP-1水平比较

图1 Western blot法测定MMP-1表达

图2 MMP-1显色结果吸光度值

图3 Western blot法测定各组TIMP-1表达结果

图4 TIMP-1显色结果吸光度值

3 讨论

桂参通脉胶囊是由桂枝、党参、黄芪、炒白术、葛根、川芎、郁金、茯苓、清半夏和延胡索等药物组成的纯中药复方制剂[3]，具有补气益心、活血通脉、化痰祛浊之功。其中桂枝、党参为君药，以助阳行气、温通经脉；黄芪、茯苓、炒白术共为臣药，以健脾、宁心、益气；葛根、郁金、川芎、清半夏、延胡索为佐药，其中前三者可升阳活血、清心解郁；延胡索可达活血散瘀、理气止痛之功。从现代药理来看，上述药物均有扩张血管、强心利尿等作用[4-7]，与现代医学治疗心力衰竭的“黄金三角”一致。

在心力衰竭心室重塑演变过程中，心肌细胞和细胞外基质(ECM)胶原网架、血管床的组成和形态结构发生改变，使得心肌顺应性及收缩力下降，从而导致心功能不全[8]。其中引起左心室扩大及心室重构的关键因素是ECM成分的合成及代谢失衡，生理状态下，ECM是连接心肌细胞的重要组成部分，起着信息传递、细胞支架及协调心肌舒张收缩功能的重要作用，对维护心脏结构与功能完整性有重要意义。而胶原代谢过程因受众多因素调控而更为复杂，基质金属蛋白酶( MMPs) 是一类含有锌离子的内源性蛋白水解酶，当pH值合适时，其可将ECM 的大部分成分完全降解，内源性抑制剂基质金属蛋白酶抑制剂(TIMPs) 作为MMPs 的天然抑制剂。MMP/TIMP介导的胶原降解是心肌重塑和心功能不全的主要过程[9]。

MMP-1是 MMPs家族中的一员，参与细胞外基质调节过程及心肌重构，且发挥重要作用，其来源于心肌纤维细胞的分泌，正常人组织中MMP-1表达水平极低，但在病理性修复或重塑过程中，细胞因子等因素刺激情况下，体内MMP-1水平明显增加。当心肌细胞受损时，MMP-1 将被大量释放到血清中，导致血清中MMP-1水平显著上升[9]。TIMP是一种内源性糖基化蛋白质，作用是抑制MMPs的生物活性，可调控MMPs的生物活性与代谢，调节细胞增殖、分裂与死亡；由成纤维细胞、其他结缔组织细胞及较广范围的其他细胞所分泌，广泛存在于组织和体液中与MMP-1有高度亲和性，抑制其活性表达。因此，TIMP-1/MMP-1的平衡是活性中心以1∶1的比例结合，阻断MMP-1与底物的结合，抑制其活性，从而减少MMP-1对胶原基质的降解。

在心衰发展过程中，由于心脏生理性代偿机制，导致心肌间质重塑，造成心脏结构扩大，心肌顺应性减低，收缩力不足，致使心输出量减低，导致一系列并发症发生。本实验采用酶联免疫吸附法和蛋白质免疫印迹法，观察CHF大鼠MMP-1、TIMP-1水平。与正常对照组相较，心衰模型组MMP-1水平、MMP-1/TIMP-1比值明显升高，TIMP-1水平明显减低。TIMP-1对MMP-1的抑制作用减弱，细胞外基质中的胶原蛋白降解，致使重构发生。与心衰模型组比较，各用药组MMP-1水平、MMP-1/TIMP-1比值下降，TIMP-1水平升高。针对MMP-1，下降最为显著的是桂参通脉胶囊高剂量组，中剂量组次之。针对TIMP-1，上升最为显著的是桂参通脉胶囊高剂量组，中剂量组和卡托普利组次之。桂参通脉胶囊高剂量组MMP-1水平、MMP-1/TIMP-1比值下降，TIMP-1水平升高，优于卡托普利组。

综上，笔者认为桂参通脉胶囊能降低CHF大鼠MMP-1水平，提高TIMP-1的表达，降低MMP-1/TIMP-1比值，延缓CHF发展，逆转心室重构。