金钱蒲组织培养再生体系建立的研究

张可凡，李勇学，陈 瑶，周 蓉，谢晓玲，邓自发

(南通大学生命科学学院，江苏 南通 226019)

金钱蒲(Acorusgramineus)又称钱蒲、随手香，系天南星科菖蒲属，多年生草本植物，株高10～20 cm，分枝丛生，全株具香气，主要通过根茎分株的方式进行繁殖[1-5]。金钱蒲具有较高的药用价值、园林价值、文化价值、经济价值和生态修复功能[6,7]，是一种极具开发利用价值的观赏性植物。对金钱蒲的研究主要集中在文化和医药价值上，同时对其根茎挥发油化学成分和活性的研究也比较广泛[8-10]，但是在组织培养等快繁技术开发方面的研究未见报道。目前金钱蒲扩繁主要采用土培方式，由于该方式培育周期长，受病虫害等外部环境因素影响大，难以实现规模化、标准化生产，无法满足市场需求，因此展开金钱蒲组培快繁研究和技术开发具有重要的意义。

本研究以金钱蒲分蘖茎基部为外植体，对其组培过程中的消毒、诱导、增殖、生根和炼苗移栽等环节影响因素及关键参数进行探索和优化，从而有效提高金钱蒲组培苗的扩繁系数，建立一种保质保量快速有效的金钱蒲组培繁育体系，以满足市场需求，为金钱蒲种质资源的保护、优质种质的开发利用和规模化生产提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试验材料为金钱蒲，选取分蘖茎基部作为组培外植体。

1.2 材料的消毒处理

先用清水清洗金钱蒲表面污渍，然后剪取分蘖茎基部放入烧杯中，用洗衣粉溶液浸泡20 min，再用蒸馏水冲洗1 h，将材料表面残留的洗衣粉溶液冲洗干净，最后将其放置在无菌室内的超净工作台上进行消毒处理。

在无菌室内的超净工作台上，将剪取的分蘖茎基部先用75%乙醇消毒10 s后用无菌水冲洗3遍，接着用0.1%升汞浸泡8 min后再用无菌水冲7遍，最后用无菌滤纸吸干表面水分，接种于诱导培养基上。

1.3 不同激素配比对初代分化芽诱导的影响

以MS培养基为基本培养基，植物生长调节剂种类和浓度采用L9(33)正交设计，选择2,4-D、6-BA、NAA 3个因素，每个因素设置3个质量浓度水平，因素水平见表1。将消毒处理后的金钱蒲外植体接种于初代诱导培养基上，要求每个试验处理接种15个外植体，重复3次。培养35 d后观察记录，统计分化芽开始时间、平均芽长、平均分化芽数和诱导率。

诱导率(%)=(分化芽数/外植体数)×100%。

1.4 不同激素配比对分化芽继代增殖的影响

自初代培养的基础上继续以MS为基本培养基，探究不同质量浓度NAA(0.5、1 mg·L-1)和6-BA(0.5、1、1.5、2 mg·L-1)组合对继代增殖培养的影响。当外植体初代诱导出4～6片嫩叶时进行转接，转入增殖培养基中，多次反复转接进行继代培养(继代转接2～3次)，要求每个试验处理接种15个分化芽，重复3次。继代培养35 d为1个周期，培养周期末观察记录，统计平均增殖芽数和增殖系数(增殖系数=平均增殖芽数/接种芽数)。

表1 不同激素配比正交试验(L9(33))

1.5 不同激素配比对试管苗生根诱导的影响

以1/2 MS为基本培养基，选用NAA、2,4-D和IBA 3种激素对组培试管苗进行生根培养。采用Design-Expert 8.0.6统计分析软件进行响应面设计实验，按照Box-Behnken试验设计，对试管苗生根诱导的激素进行筛选。以NAA、2,4-D和IBA 3种激素质量浓度为单因素，每个因素取3水平，以平均生根数为响应值，设计3因素3水平的响应面试验(表2)。当继代增殖培养基上的外植体长出3～4个分蘖(增殖出的嫩叶有20～30片)时进行转接，转入添加有2 mg·L-1活性炭的生根培养基中，每个试验处理接种15个试管苗，重复3次。培养35 d后观察记录，统计平均生根数和生根率。

生根率(%)=(生根数/接种苗数)×100%。

表2 Box-Behnken设计3因素3水平

1.6 不同移栽基质对无菌苗移栽的影响

当生根培养基中的试管苗诱导出5～10条不小于2 cm的根时，将无菌苗转移到炼苗室，在闭瓶条件下接受室温和自然光5～7 d；然后，打开组培瓶膜再接受室温和自然光5～7 d。瓶内驯化完之后，从炼苗室移出，用25 ℃左右的清水洗去培养基，再用0.1%多菌灵浸泡根部10～20 min，然后分别移栽于珍珠岩∶蛭石=1∶1、泥炭土∶珍珠岩=1∶1、泥炭土∶蛭石=1∶1这3种移栽基质中，要求每个试验处理接种15个无菌苗，重复3次。培养35 d后观察记录，统计成活率。

成活率(%)=(成活苗数/移栽苗数)×100%。

1.7 培养条件

培养基添加琼脂0.7%，蔗糖3%，pH 5.8～6.0；培养温度(25±2)℃，相对湿度60%～70%，每天光照14 h，光照强度1 500～3 000 lx。

1.8 数据统计与分析

用SPSS 22.0分析软件对初代和继代培养指标进行统计分析，采用Duncan法进行多重比较，生根诱导数据采用Design-Expert 8.0.6统计分析软件进行。

2 结果与分析

2.1 不同激素配比对初代分化芽诱导的影响

将经过消毒处理后的金钱蒲分蘖茎基部接种到添加有不同浓度配比植物生长调节剂的MS基本培养基中。一般接种7 d左右分蘖茎基部开始分化芽，大概2周后开始长出新叶，35 d左右逐渐趋于稳定，统计其分化的芽数和芽长。

从表3可知，不同的激素组合配方对金钱蒲分蘖茎基部的影响不同，由极差分析中的R值得出，各因素对分蘖茎基部影响作用的顺序为：6-BA>NAA>2,4-D。结果表明，6-BA对分蘖茎基部初代诱导的影响最大，是诱导分蘖茎基部分化的主要因素，其次是NAA和2,4-D。在设计的这9种处理中，处理4(2,4-D 0.5 mg·L-1+6-BA 1.5 mg·L-1+NAA 0.5mg·L-1)为最优组合，效果最佳，全部分化时间较短(7 d)，平均分化芽数最多(3.89个)，平均分化芽长相对较长(1.10 cm)(诱导效果见图1)。

表3 不同激素配比对分蘖茎基部初代诱导的影响

2.2 不同激素配比对分化芽继代增殖的影响

以MS为基本培养基，添加不同浓度的NAA和6-BA，观察比较其对金钱蒲分蘖茎基部继代增殖的影响。研究结果表明，不同浓度的NAA和6-BA对分蘖茎基部继代培养的影响具有明显差异(表4)。当添加6-BA 2 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1时，其效果最好，平均增殖芽数最多(13.89个芽)，增殖系数最大，达到了2.67(继代增殖效果见图2)。

图1 初代诱导情况

注：a为第1次继代培养；b为第2次继代培养后。图2 继代增殖培养情况

表4 不同质量浓度6-BA和NAA配合使用对分蘖茎基部继代增殖的影响

2.3 不同激素配比对试管苗生根诱导的影响

为对比NAA、2，4-D、IBA 3种生长素在0.1～1 mg·L-1的质量浓度范围内对试管苗生根培养的影响，以NAA(A)、2，4-D(B)、IBA(C)质量浓度为因素，采用Box-Behnken方法设计响应面分析试验，并进行了回归方程的显著性检验及方差分析(表5)。

表5 回归方程显著性检验及方差分析(平均生根数)

二次模型中回归系数的显著性检验表明，NAA、2，4-D对生根诱导平均生根数的线性效应极显著(p<0.01)，IBA对平均生根数的线性效应显著(p<0.05)；因素AB、AC对平均生根数的交互影响不显著，BC对平均生根数的交互影响极显著；因素A2、C2对平均生根数的曲面效应极显著，因素B2对平均生根数的曲面效应显著。对试验数据进行多次拟合回归，以平均生根数(Y)为因变量，NAA(A)、2，4-D(B)、IBA(C)为自变量建立回归方程模型为Y=0.609 50+14.717 00A+8.259 50B+5.819 50C+0.730 00AB-0.930 00AC-2.940 00BC-7.702 00A2-1.572 00B2-3.352 00C2。

图3 不同激素种类与平均生根数的响应面分析

图4 生根培养情况

该模型的回归F值为215.54，经拟合检验，p<0.01，表明该回归极显著，模型对试验实际情况拟合较好。决定系数(R2)=0.996 4，校正决定系数(R2adj)为0.991 8，变异系数越低，模型的置信度越高，表明该模型与实际的试验拟合程度良好，误差小，模型选择合适，说明该方程能够正确反映平均生根数和不同激素之间的关系，可以用该模型对响应值进行分析和预测来确定最佳激素配比。

根据回归方程Y=0.609 50+14.717 00A+8.259 50B+5.819 50C+0.730 00AB-0.930 00AC-2.940 00BC-7.702 00A2-1.572 00B2-3.352 00C2，绘制不同激素种类与平均生根数的响应面分析图(图3)。通过Design-Expert 8.0.6统计分析软件优化，获得最佳激素配比为NAA 0.99 mg·L-1+2,4-D 1 mg·L-1+IBA 0.29 mg·L-1，预测平均生根数为15.33个。为检测结果的可靠性，采用最佳激素配比进行验证，结果得出平均生根数为15.02个，生根率也达到了93.33%(生长情况见图4)，因此验证了预测结果的正确性，说明响应面分析法得到的激素配比真实可靠。

2.4 不同移栽基质对无菌苗移栽的影响

由表6可知，不同移栽基质对金钱蒲无菌苗移栽成活率的影响不尽相同，珍珠岩∶蛭石=1∶1的成活率明显高于其他基质，达到91.11%，且叶片深绿、无枯叶现象，最适合作为金钱蒲移栽培养的基质(移栽效果见图5)。

表6 不同移栽基质上生根苗移栽成活率

3 讨论与结论

在植物组织培养中，不同消毒剂和消毒时间的选择对外植体污染的影响较大，正确选择消毒剂的种类、浓度和处理时间可以有效降低污染率，减少组织细胞死亡，提高外植体的存活率和诱导率，达到最好的诱导效果[11-18]。实验发现分蘖茎基部最适宜作为金钱蒲组培外植体，且采用75%酒精10 s+0.1%升汞8 min的消毒效果最佳。

图5 移栽至珍珠岩∶蛭石=1∶1基质中培养35 d的生根苗

实验结果表明，不同基本培养基和不同激素组合配方对金钱蒲分蘖茎基部初代诱导和继代增殖的影响不尽相同，但总体趋势同文献报道一致：生长素和细胞分裂素的比值低时，有利于芽的形成[19,20]；诱导生根的基本培养基无机盐浓度的降低，有利于根的分化[21]，而生根诱导成败的关键是植物生长调节剂的种类和浓度之间的配比。本项研究中分蘖茎基部初代诱导的最佳配方为：MS+2,4-D 0.5 mg·L-1+6-BA 1.5 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1；继代培养的最佳配方为：MS+6-BA 2 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1；生根诱导的最佳配方为1/2 MS+NAA 0.99 mg·L-1+2,4-D 1 mg·L-1+IBA 0.29 mg·L-1+活性炭2 g·L-1。炼苗最好的方式是：在闭瓶条件下接受室温和自然光5～7 d；然后，打开组培瓶膜再接受室温和自然光5～7 d。移栽基质以珍珠岩∶蛭石=1∶1效果最好，最适合作为金钱蒲移栽培养的基质。

研究表明多因素实验设计中全面试验的最大优点是可获得更多的信息量，但需要最多的试验次数；正交试验设计布点均衡、结果直观容易分析，可以实现以最少的试验次数达到与大量全面试验等效的结果，是一种高效、快速而经济的多因素试验设计方法。因此，在植物组织培养试验设计上多采用正交试验设计方法；而响应面设计可以得到高精度的回归方程，并能得到精确的因素水平值，减少最佳条件下效应的预测值和实测值之间的偏差[22]。在本项研究的初代诱导阶段采用正交试验设计，继代增殖阶段采用全面试验设计，生根培养阶段尝试采用响应面试验设计，从研究结果可以看出3种实验设计都能较好的优化实验方案，但和全面试验、正交试验设计相比，响应面设计的实验结果能提供更多的信息，因此在后续研究中将加强不同试验设计的优缺点分析，根据因素和水平的设置情况选择更为有效的实验方案达到事半功倍的效果。

相比于传统土培繁育技术，金钱蒲组培快繁技术繁育速度较快，生长周期较短，1个周期的繁殖倍数可达4倍左右；无菌苗健壮，少病虫害，根系发达，具有很强的生命力；实现了金钱蒲的高密度栽培，既省时、省力、有效率，又节约了土地资源和生产成本，而且解决了养分吸收利用率低下的问题。

综上所述，本试验通过对金钱蒲组织培养外植体选择、消毒处理、初代培养、继代培养、生根培养和炼苗移栽等方面进行的研究，基本找到了金钱蒲组织培养快繁适宜外植体、灭菌条件和培养基配方，初步建立了金钱蒲组织培养快繁体系，为实现金钱蒲规模化、标准化生产和大面积的推广奠定基础。