含水量对超低温保存后马尾松种子生理生化特性的影响

张晓宁，张 烨，肖玉菲，姚瑞玲，陈博雯，覃子海，刘海龙

(1.广西壮族自治区林业科学研究院，南宁 530002；2.广西优良用材林资源培育重点实验室，南宁 530002)

超低温保存(cryopreservation)是指在不高于-100 ℃条件下保存生物材料，常用液氮(-196 ℃)作为冷源[1]；在此温度下，能最大限度地抑制生理代谢活动，降低劣变频率。超低温保存是目前为止集简便、实用、低成本、占地少于一体的一种长期保存种质资源的方法[2]，在农作物[3]、果蔬[4]、中药材[5]及林木种子[6-7]方面都有研究。

马尾松(PinusmassonianaLamb)从种子发芽到进入繁殖期时间间隔较长(实生植株约在第6年才进入正常的开花结实期)[8]，而常温开放保存时间较短(3～4年几乎全部丧失发芽力)，即便在2～4 ℃低温密闭条件下也只能维持10年左右[9-10]。因此，开展超低温保存研究对延长马尾松保存期限具有现实和必要意义，除了资源安全外也为其种质资源的交流、遗传改良和良种推广等生产实践和科学研究提供了可靠的物质保障[11]。

项目组前期对马尾松种子进行了超低温保存研究，结果表明，含水量是影响其冻存效果的关键影响因子，在含水量为6.1%时获得高达91.33%的冻后发芽率[12]。超低温保存不仅对种子生活力产生影响，还会对种子的生理生化特性产生影响[13]，许多研究通过测量材料生理生化特性判断超低温保存效果[14,15]。

本研究在此基础上，对不同含水量马尾松种子冻存后REC、MDA、抗氧化物酶、非酶抗氧化剂、渗透调节物质的变化进行了研究，旨在从生理角度揭示不同含水量下各生理指标的变化规律，阐述其损伤/保护的生理机制，为进一步提高马尾松保存效果提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

成熟马尾松(PinusmassonianaL.)种子于2016年11月采自广西藤县，千粒重为11.4 g，发芽率为90.25%，初始含水量为9.56%。利用浸种和硅胶干燥的方式获取27.4%、22.7%、16.8%、10.7%、6.1%、4.8%、3.2%等7个含水量梯度的种子，不同含水量的种子冻存后发芽率见表1(见参文献[12])。设对照组和试验组，对照组直接测定生理指标，试验组经超低温保存后测定其生理指标。

表1 不同含水量马尾松种子冻存后发芽率

1.2 测定方法

相对电导率(REC)的测定参见任淑娟等[16]的方法；丙二醛(MDA)质量摩尔浓度采用硫代巴比妥酸(TBA)法测定；超氧化物歧化酶(SOD) 活性采用黄嘌呤氧化酶法测定，过氧化物酶(POD)活性采用愈创木酚比色法测定，过氧化氢酶(CAT)活性采用磷钼酸法测定；AsA(Vc)含量采用菲咯啉比色法测定；可溶性糖、可溶性蛋白含量分别采用蒽酮法和考马斯亮蓝法测定。

1.3 数据分析

采用Microsoft Office Excel(2016)软件对试验数据进行整理作图，采用SPSS 19.0软件对实验数据进行方差分析、多重比较、生理生化指标的相关性及主成分分析。试验结果为3个重复的平均值±标准误。

2 结果与分析

2.1 MDA和种子浸出液REC的变化

如图1， REC和MDA含量受含水量影响显著，随含水量增加，变化趋势大体相同，均为先降后升，在含水量为6.1%时，REC和MDA含量最低，分别为15.33%和5.61 nmol·g-1，表明该含水量下质膜电解质外渗量少，脂质过氧化程度低，受到的损伤小。与MDA不同的是，REC表现出一个较广的适应范围，在含水量为4.8%～10.7%时，电导率值均较小，无显著差异。

图1 含水量对马尾松种子冷冻保存后浸出液REC和MDA的影响

2.2 抗氧化物酶活性及非酶抗氧化剂含量的变化

不同含水量POD活性(图2)变化呈升—降—升—降的双峰型，在4.8%，6.1%和22.7%时最高，在10.7%时最低。CAT活性(图2)随含水量增加总体呈下降的趋势，在含水量为3.2%～10.7%的范围内活性较高，同样表现出一定程度的广适性。当含水量大于10.7%时，CAT 活性逐渐下降。SOD活性(图3)总体呈先升后降的趋势，在6.1%时达到最高值(577.92 U·g-1)，后逐渐下降，直至含水量为16.8%时，达到最低值(414.31 U·g-1)，含水量继续增加，SOD活性小幅上升。AsA含量变化与POD类似，呈双峰形状，在含水量为6.1%和22.7%时含量较高，低于4.8%时含量较低。

图2 含水量对马尾松种子冷冻保存后POD,CAT活性的影响

图3 超低温保存对不同含水量马尾松种子SOD活性，AsA含量的影响

2.3 可溶性糖(SS)和可溶性蛋白(SP)含量的变化

SS和SP含量变化如图4所示，SS在含水量为4.8%～10.7%时较高，在含水量小于4.8%或大于10.7%时显著降低。SP随含水量升高波动性变化，含水量为4.8%～6.1%时，达最大值。

图4 超低温保存对不同含水量马尾松种子SS和SP含量的影响

3 结论与讨论

植物材料在超低温保存过程中，易受到代谢胁迫、脱水胁迫、结冰伤害及由此带来的机械损伤等，从而使其不同部位受到不同程度的损伤[17]。种子在低温逆境时，最先受损伤的是细胞膜系统[18]。脱水、冷冻和降温都可能会使细胞膜的脂质层发生相变(由液晶态转变为凝胶态)，膜系统收缩，出现裂缝或通道，导致膜透性增加，细胞吸涨时，胞内电解质外渗，溶液电导率(REC)升高，因此，REC与膜受损伤的程度呈正相关[17]。本研究中，REC在含水量为6.1%时，达最低值，表明在此含水量下膜通透性较小，细胞膜系统受到的损伤较轻[19]。含水量增加或减少时，REC均增加，含水量太高容易导致冷冻和化冻阶段结冰使膜系统受到机械损伤，含水量太低在回复培养时会因快速复水产生吸涨伤害，太低的含水量也会降低种质活性，最终影响超低温保存效果[13,17]。

氧化伤害是超低温保存过程中的次生伤害之一，逆境胁迫(包括低温和脱水)会导致细胞内活性氧(ROS)的产生和积累，过量的ROS可使膜脂的不饱和脂肪酸发生过氧化作用，最终生成MDA[20,21]， MDA对细胞有毒害作用，可降低SOD，POD等抗氧化物酶的活性，使蛋白质的结构和功能发生变化[22]； SOD，POD，CAT及AsA是重要的保护酶和非酶保护剂，可将过量有毒的ROS转化成无毒害的O2和H2O等物质。在含水量为6.1%时，MDA含量最低，各种抗氧化物酶活性和非酶抗氧化剂含量均达到最大。表明在此含水量下抗氧化能力较强，自由基水平较低，细胞膜系统受到的损伤较轻[14,19]。POD活性在4.8%，6.1%和22.7%时达到最大，一方面体现了其保护效应，高活力种子具有高的抗逆酶活性[23]。另一方面推测高含水量下POD参与ROS的产生，表现出对细胞的伤害效应[24]。POD的伤害效应在金丝李种子的研究中有报道，当种子含水量超过10.7%时，金丝李种子POD活性迅速增加[25]。CAT活性随含水量增加呈下降趋势，这与珙桐离体胚轴结果一致，表明高含水量下冷冻材料受到了一定程度的损伤[26]。

植物的超低温耐性受植物体内保护性物质影响。可溶性糖和可溶性蛋白作为重要的保护性物质，可通过增加细胞液浓度，降低细胞渗透势，提高细胞保水能力，降低细胞冰点，提高植物超低温耐性[17,27]。本研究中，在含水量为6.1%时，可溶性糖和可溶性蛋白的含量均达到最大。宋红等对玉婵花的研究结果也表明，适当降低含水量，可溶性蛋白质量分数上升，有利于保持种子的低温耐性，冻后发芽率显著升高[15]。

值得指出的是，在本研究中许多生理指标的最优值(统计学上无显著性差异)都是一个相对较宽的含水量范围，如REC值在含水量为4.8%～10.7%时较低；POD和CAT活性分别在含水量为4.8%～6.1%和3.2%～10.7%时较高；SS和SP含量分别在含水量为4.8%～10.7%和4.8%～6.1%时较高，这体现了正常型种子相对较广的安全含水量范围[12]。

本研究通过对生理指标的测量，进一步从生理层面证明6.1%左右的含水量为超低温保存的最适含水量，揭示了影响超低温保存效果的生理机制，即细胞膜透性小、膜脂过氧化程度低、细胞抗氧化能力强、胞内渗透调节物质浓度高，为进一步提高马尾松种子超低温保存效果，从分子层面解析超低温保存机理提供了理论基础。