超高效液相色谱-串联质谱法测定饮用水中的磺胺类药物残留

赵超群， 刘 柱， 袁 堃， 罗金文

(浙江省食品药品检验研究院，浙江杭州 310052)

磺胺类药物是指具有对氨基苯磺酰胺结构一类药物的总称，该类药物用于预防和治疗细菌感染性疾病，具有抗菌谱广、抗菌效果明显、性质稳定、价格便宜等优点[1]，目前大量用于防治畜禽细菌性感染疾病。我国天然地表水中药物残留含量最高、分布最广的即为磺胺类药物。磺胺类药物可通过多种途径进入水环境，如医疗排废、畜禽养殖和水产养殖等。但该类药物在环境中不易降解，并且通过食物链的富集，导致越来越多的耐药菌产生，最终可能会危害人体健康[2，3]。水环境中磺胺类药物的残留问题已越来越引起人们的重视，国内外已有大量的研究报道了其在各种水环境中的残留状况[4 - 6]。

磺胺类药物目前常用的检测方法主要有免疫分析法[7]、毛细管带电泳法[8]、气相色谱法[9]、液相色谱法[10，11]、液相色谱-串联质谱法[12 - 14]。液相色谱 - 串联质谱法是测定磺胺类药物最常用的检测手段。四极杆-线性离子阱(QTRP)既保留了串联四极杆较好的选择性和灵敏度，也可作为线性离子阱增强二级碎片离子定性功能，采用多反应监测-信息依赖型采集-增强子离子扫描(MRM-IDA-EPI)模式检测，一次进样即可得到用于定量的MRM图谱和用于定性的二级图谱，更有利于微量目标化合物的定性[15]。本研究采用固相萃取技术对目标化合物进行净化和富集，应用同位素内标法，采用超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)的MRM-IDA-EPI分析模式，并建立多能级检索谱库，为饮用水中磺胺类化合物的检测提供新途径。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

AB5500-QTRAP质谱仪(美国，AB Sciex公司)；LC-30AD超高效液相色谱仪(日本，Shimadzu公司)；全自动氮气吹干仪(美国，Biotage公司)；Milli-Q型超纯水器(美国，Millipore公司)；全自动固相萃取仪(中国睿科公司)；XPE-205电子天平(瑞士，Mettler toledo公司)；QT-1涡旋混合器(上海琪特公司)。Waters Oasis HLB固相萃取柱(6 cc，500 mg，美国，Waters公司)。

磺胺乙酰(SAA)、磺胺噻唑(STZ)、磺胺吡啶(SPD)、磺胺甲基嘧啶(SMR)、磺胺二甲恶唑(SMO)、磺胺二甲嘧啶(SDM)、磺胺甲噻二唑(SMT)、磺胺氯哒嗪(SCP)、磺胺甲恶唑(SMZ)、磺胺二甲异恶唑(SFZ)、磺胺苯甲酰(SBA)、磺胺苯吡唑(SPA)、磺胺喹恶啉(SQX)标准物质，均购自Dr.Ehrenstorfer GmbH，纯度均大于98.0%；磺胺嘧啶(SDZ)、磺胺甲氧嗪(SMP)、磺胺间甲氧嘧啶(SMM)标准物质购自中国食品药品检定研究院，纯度均大于97.5%；磺胺索嘧啶(SIM)标准物质购自北京坛墨质检科技有限公司，纯度为99.1%。同位素内标磺胺喹恶啉-13C6(SQX-13C6)、磺胺甲基嘧啶-13C6(SMR-13C6)购自WiTEGA，磺胺地索辛-D6(Sulfadimethoxine -D6)购自ANPEL，磺胺甲恶唑-D4(Sulfamethoxazole -D4)购自CDN Isotopes INC。甲醇、乙腈(色谱纯，德国默克公司)；Na2EDTA、HCl(分析纯，国药集团)；甲酸(质谱纯，美国Roe Scientificing公司)。

1.2 标准溶液配制

1.2.1 对照品储备液分别精密称取17种磺胺类药物10 mg(精确至0.01 mg)，用甲醇溶解并定容至10 mL，配制成1 000 μg/mL的标准储备液，于-18 ℃下保存。分别精密移取STZ、SPD、SMR、SDM、SMT、SMM、SMZ、SFZ、SPA标准储备液100 μL，SAA标准储备液500 μL，SDZ、SMO、SMP、SBA、SIM标准储备液200 μL，SCP标准储备液50 μL，SQX标准储备液400 μL，用甲醇定容，即得混合对照品中间液，于-18 ℃下保存。

1.2.2 同位素内标储备液分别精密称取SQX-13C6、MSDS -D6、SMR-13C6、磺胺甲恶唑-D4各1 mg，用甲醇溶解并定容至10 mL，配制成100 μg/mL的内标储备液，于-18 ℃下保存。精密移取100 μL各同位素内标储备液，用甲醇定容至100 mL，即得100 ng/mL的同位素内标中间液，于-18 ℃下保存。

1.3 样品处理

采集自来水水样于1 L棕色玻璃瓶中，在4 ℃保存，采集后尽快进行前处理，保存时间不超过3 d。10批矿泉水购于浙江市场。取500 mL待测水样，精密加入100 μL混合同位素内标中间液，经0.7 μm孔径玻璃纤维滤膜过滤，加入0.2 g Na2EDTA混合溶解后，用0.1 mol/L HCl调pH至3.0，上样至预先活化的HLB固相萃取小柱(4 mL甲醇、4 mL水活化，5 mL pH为3.0的稀HCl平衡)，控制流速为3～5 mL/min，用5 mL 5%甲醇水溶液淋洗，抽干后用10 mL甲醇洗脱，于40 ℃氮吹至近干，用50%甲醇水溶液定容至1.0 mL，过0.22 μm有机滤膜，待上机分析。

1.4 仪器工作条件

1.4.1 色谱条件色谱柱：Waters CORTECS T3柱(100 mm×2.1 mm，2.7 μm)；流动相：A为0.1%甲酸溶液，B为乙腈。梯度洗脱程序：0.01～2.0 min，10%B；2.0～6.0 min，10%～60%B；6.0～8.0 min，60%B；8.0～8.1 min，60%～10%B；8.1～10.0 min，10%B。流速：0.35 mL/min；柱温：35 ℃；进样量：2 μL。

1.4.2 质谱条件电喷雾离子源，正离子(ESI+)扫描；喷雾电压5.5 kV；雾化气压力(GS1)50 psi，辅助器压力(GS2)50 psi，气帘气压力(CUR)40 psi；优化后的母离子、子离子和锥孔电压、聚焦电压、碰撞能量等MRM参数见表1。

采用MRM-IDA-EPI模式检测，建立在线EPI谱库检索辅助定性分析，同位素内标法定量分析，IDA参数：启动EPI阈值为5 000 cps，采用动态背景扣除模式；EPI参数：扫描速度10 000 Da/s，扫描范围为m/z50～320 Da，采用动态填充肼集时间，不大于1 ms，EPI碰撞能量(CE)：35±15 eV。

表1 MRM模式检测下17种磺胺类药物及内标物的质谱条件

(续表1)

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

本研究考察了四种不同类型的色谱柱，基于Water CORTECS T3柱(100 mm×2.1 mm，2.7 μm)在反相液相色谱条件下对极性化合物有较好保留，且对碱性化合物有良好的选择性，实验发现其对磺胺类化合物的保留分离效果最好，因此，选择其作为色谱柱进行分离。比较了乙腈-水和甲醇-水两种流动相，结果表明，使用甲醇-水作为流动相时，分离度良好，但出现了拖尾、峰宽较宽的问题，使用乙腈-水作为流动相，分离度和峰形明显优于甲醇-水。为了进一步提高待测化合物的离子化效率，增强灵敏度，结合目前LC-MS/MS法的相关报道[16]，磺胺只有在酸性溶液中才能以分子状态存在，很好地与固定相作用而被保留和分离，且电离时能较好地生成[M+H]+而被检测。因此，最终确定流动相为乙腈-0.1%甲酸溶液，再优化流动相比例，选择梯度洗脱，目标物分离度好，保留时间适中。优化后的提取离子色谱图见图1。

图1 混合对照品的提取离子色谱(EIC)图Fig.1 EIC chromatograms of mixed reference standards

2.2 质谱条件的优化

欧盟规定LC-MS/MS检测中，物质定性时相对离子强度误差的最大允许范围不大于20%，且必须要有4个鉴别点数，即一个母离子加两个子离子才能实现定性。但是在目标化合物的浓度很低时，绝对响应也很低，极有可能会影响目标分析物的离子相对丰度比，结果的确证带来困难。本研究采用MRM-IDA-EPI扫描模式，优化MRM条件后，在扫描过程中，使MRM通道采集的信号超过5 000 cps后，触发EPI增强离子扫描，CE为20、35、50 eV时，获得对应MRM通道的母离子的增强二级离子全扫描质谱，获得足够的碎片离子信息，包含特征离子峰，实现一次进样定性定量。根据17种化合物的响应程度，优化MRM-IDA-EPI的各参数，获得增强二级离子全扫描质谱图(图2)，建立17种磺胺类药物的EPI谱库。

图2 17种磺胺类药物在线增强离子扫描(EPI)谱图Fig.2 Enhanced product ion(EPI) spectra of 17 sulfonamides

2.3 MRM-IDA-EPI谱图结果评价

以加标样品为例，浓度为25倍定量限，在具体分析过程中采用MRM-IDA-EPI模式进行检测，在各化合物对应保留时间均能获得3个不同碰撞能量的EPI谱图，在新建的磺胺类药物标准谱库中进行检索，根据低中高3个不同碰撞能量所得的EPI碎片离子混合图，每个化合物均能得到相应的EPI谱图匹配结果。以匹配值(Fit值)、反向匹配值(Revfit值)、纯度值(Purity值)作为定性结果的依据，其中Fit值代表标准物质谱图与样品谱图进行对比后获得的相似度值(满分为100)，Revfit值代表反向匹配后获得的相似度值，Purity值是综合前两种结果得出的数值[15]。加标结果显示，17种磺胺类药物的Fit值、Revfit值、Purity值均能获得满意结果，建立的EPI谱库可实现在无需对照品的情况下即能完成简单的定性，具体分析结果见表2。

表2 加标样品EPI谱库检索结果

2.4 固相萃取柱的选择

基于磺胺类化合物中含有-NH2基团，因此本实验考察了MCX、WCX、HLB和MCX与HLB联用的净化富集效果，结果表明磺胺在MCX柱上难以洗脱，因此MCX柱、MCX与HLB联用的回收率均不理想。WCX柱中磺胺二甲恶唑的回收率仅49%，而在HLB上各化合物的回收率均能介于75%～120%间，见图3。因此最终选择HLB作为净化富集柱。

图3 17种磺胺类药物在不同固相萃取柱上的回收率Fig.3 Recoveries of 17 sulfonamides on different solid phase extraction columns

2.5 前处理条件的优化

实际水样中存在一定量的重金属，会与目标化合物产生一定的螯合反应，影响最终分析结果[17]。因此实验中加入适量Na2EDTA以络合部分金属离子，提高提取效率。分别向500 mL空白自来水样中加入0、0.5、1.0、2.0 g Na2EDTA，进行加标试验，加标量为25倍定量限浓度。结果表明，随着Na2EDTA加入量增大，除络合重金属离子，同时会影响磺胺类化合物在HLB柱的吸附，在加入0.5 g Na2EDTA时各目标化合物的回收率优于其他几组，所以样品中Na2EDTA的适宜加入量为0.5 g。实验还考察了在HLB柱富集和净化过程中pH值对结果的影响，分别试验了pH为3.0和pH为7.0时目标化合物的提取回收率，结果发现pH为7.0时磺胺二甲恶唑的回收率在10%以下，pH为3.0时各化合物的提取回收效率均良好(图3)。因此，待测水样用0.1 mol/L HCl调pH至3.0后上样至固相萃取小柱分析。

2.6 方法学考察

用甲醇配制定量限至100倍定量限浓度范围的系列浓度混合标准溶液，磺胺喹恶啉-13C6作为SAA、SDM、SBA、SIM的同位素内标，磺胺甲基嘧啶-13C6作为SDZ、STZ、SMP、SMT的同位素内标，磺胺地索辛-D6作为SPD、SMR、SMO、SMM、SPA、SQX的同位素内标，磺胺甲恶唑-D4作为SMZ、SIM、SFZ的同位素内标，以待测物质的峰面积和相应同位素内标物的峰面积的比值为纵坐标(Y)，质量浓度为横坐标(X)绘制标准曲线，线性范围、线性方程及相关系数见表3。结果表明，17种磺胺类药物的线性关系良好，根据信噪比(S/N)≥3及S/N≥10分别确定方法的检出限(LOD)和定量限(LOQ)，结果见表3。

表3 水中磺胺类药物的线性关系、检出限、定量限和回收率(n=6)

对空白水样进行加标回收试验，加标量为5、25、50倍定量限水平，每个浓度设定6份平行样，分别考察回收率和相对标准偏差(RSD)。结果表明，各目标化合物的回收率为72.4%～119.9%，RSD为0.4%～8.8%。混合标准工作液重复进样6次，考察仪器精密度，其RSD为2.1%。该方法具有良好的准确性和精密度，可满足饮用水中磺胺类药物的检测。

2.7 实际样品分析

采用本实验建立的方法对20份自来水水样及10份矿泉水水样进行分析，其中20份自来水采样自杭州市各个区，每个区随机采样2份；10份矿泉水购自超市不同品牌。通过比较待测溶液与标准溶液的谱图定性目标分析物，30份样品中均未检出磺胺类化合物，结果说明在市民平时的饮用水中，磺胺类抗菌药处于安全水平。

3 总结

本实验采用固相萃取技术富集浓缩，以超高效液相色谱-串联质谱联用技术，建立了饮用水中17种磺胺类药物残留的检测方法。通过方法学评价，证明在定量限到200倍定量限范围内线性关系良好，平均回收率在72.4%～119.9%，RSD为0.4%～8.8%。本研究为饮用水中磺胺类药物残留的检测提供了新途径。