气相色谱-静电场轨道阱高分辨质谱法辅助鉴定酱油未知的气味活性化合物

冯云子，周 婷，蔡 宇，陈子杰，赵谋明,

（1.华南理工大学食品科学与工程学院，广东 广州 510641；2.赛默飞世尔科技（中国）有限公司，上海 201206）

在食品的众多挥发性化合物中，仅有一小部分的物质赋予食品特殊的香气属性，并在食品特征香气呈现中起主要作用，具有这类性质的挥发性组分，被称之为气味活性化合物[1-2]。现阶段，气味活性化合物的研究多采用气相色谱-质谱-嗅闻（gas chromatography-mass spectrometry-olfactometry，GC-MS-O）联用技术，即利用分流口，将经GC毛细管柱分离后得到的组分分流到检测器（MS）以及嗅探口，同时完成质谱碎片的信息收集及香气特征的嗅辨，然后通过比对谱库信息、标准品的质谱、保留指数和香气特征等，鉴定样品的关键气味活性化合物。这些技术的应用使得大量的气味活性化合物被鉴定出来，迄今为止，已有约300 种[3]。

目前与嗅闻仪联用的质谱技术多以单位质量分辨率的四极杆质谱为主，由于仪器检测限及分辨率不足的原因，往往存在一些香气活性区域无法准确定性的现象，可能的原因是待测物质含量低于四极杆质谱检出限，或和其他物质在色谱上共流出而无法有效分离等，从而造成食品中香气活性物质的分离常有“未知物质”的存在。本团队前期围绕酱油气味活性化合物做了大量工作，从高盐稀态酱油和日式酱油中分别嗅闻到61 个和39 个香气活性区域，但共有3 个香气区域无法鉴定，分别表现出“坚果香”和“甜香”等[4-5]。Steinhaus等[6]在酱油中检测出15 个稀释因子大于8的香气活性区域，其中也有2 个“焦糖香”的香气活性物质未定性。香气的阈值为10-4～10-9不等，因此，以高含量存在的挥发性化合物不一定具有香气贡献，同理，痕量浓度的一些挥发性化合物可能具有强烈的香气活性[7]，如食品中的含硫化合物、酯类化合物等。这一类“未知”气味活性化合物的分析是近年来食品风味行业亟待解决的难题。

低分辨质谱（low resolution mass spectrometry，LRMS）仪面对实际复杂基质的样品时，定性、定量分析能力受限于质量分析器本身。与GC技术广泛联用的高分辨质谱包括扇形磁式质谱仪、飞行时间质谱仪和静电场轨道阱质谱（orbitrap-mass spectrometry，Orbitrap-MS）仪。其中磁质谱受限于磁场扫描速度，不适用于全扫描的定性分析，而飞行时间质谱局限于本身的分辨率、灵敏度和线性范围，二者都不是完美的质量分析器[8]。自2005年Alexander Makarov发明的Orbitrap-MS技术首次被商用后，涌现出大量关于蛋白质组学、液相色谱联用的研究，展现了这一近乎完美的质谱新技术在化合物定性、定量分析上的巨大优势[9]。2015年，首款与GC联用的Orbitrap-MS问世，分辨率高达120 000（m/z200，FWHM）、质量偏差小于1×10-6、灵敏度高至ng/L水平，为GC-MS技术的深度和广度推进提供了更多可能[10]。GC-Orbitrap-MS目前已被广泛应用于检测食品中农药残留[11]、环境中挥发性化合物和持久性有机污染物[12]、包材中可溶出物与可萃取物[13]、尿液中兴奋剂与禁用药物[14]、代谢组学[15]等。然而，用于食品风味成分分析鲜见报道。

本实验以酱油为例，通过固相微萃取提取、富集香气化合物，运用GC-Orbitrap-MS，辅助气相色谱-单四极杆质谱-嗅闻（gas chromatography-quadruple-mass spectrometry-olfactometry，GC-Q-MS-O）联用法鉴定“未知”气味活性化合物，该法与传统GC-MS-O相比，能更全面、准确地鉴定食品中的气味活性化合物，有利于食品香气重构模型的建立，对食品风味的研究有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

商业酱油市购，采用高盐稀态发酵工艺，样品存储在原始容器中，并贮藏于4 ℃。

苯乙醛（95%）、3-甲基丁酸（99%）、3-甲硫基丙醛（98%）、4-乙烯基愈创木酚（≥98%）、愈创木酚（99%）、异丁酸乙酯（99%）、3-羟基-2-甲基-4-吡喃酮（麦芽酚，99%）、2,5-二甲基-4-羟基-3(2H)-呋喃酮（2,5-dimethyl-4-hydroxy-3(2H)-furanone，HDMF，≥99%）、5-乙基-4-羟基-2-甲基-3(2H)-呋喃酮（5-ethyl-4-hydroxy-2-methyl-3(2H)-furanone，HEMF，异构体混合物，96%）、2-甲基-3庚酮（99%，内标）、正构烷烃标准品（C6～C33，99%） Sigma（上海）有限公司；4-乙基苯酚 Fluka（上海）有限公司；3-甲基-1-丁醇（99.8%）、丁酸乙酯（≥99.5%）、1-辛烯-3-醇（98%）、2-甲基丁酸（98%）、4-乙基愈创木酚（98%）、2-苯基乙醇（98%）、二甲基三硫化物（98%）、3-甲硫基丙醇（99%）、异佛尔酮（97%）、2,5-二甲基吡嗪（98%） Aladdin（上海）有限公司；二氯甲烷（分析纯） 国药集团化学试剂有限公司；无水硫酸钠（分析纯） 江苏强盛功能化学股份有限公司。

1.2 仪器与设备

Trace 1310气相色谱仪、ISQ II四极杆质谱仪、TriPlus RSH自动进样器、TR-5ms弹性石英毛细管色谱（60 m×0.25 mm，0.25 μm）柱、Q Exactive静电场轨道阱高分辨质谱、TraceGOLD TG-5SilMS毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm） 美国Thermo Fisher Scientific公司；75 μm CAR/PDMS固相微萃取头 美国Supelco公司；ODO II嗅闻仪 澳大利亚SGE公司；EL 204/EL 3002电子天平 梅特勒-托利多仪器有限公司；HHW-21CO-6W型电热恒温水浴锅 上海福玛实验设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 固相微萃取

采用前期优化好的固相微萃取方法[16]。将8 mL酱油样品加入20 mL顶空进样瓶中，加入20 μL内标（1.724 mg/L的2-甲基-3-庚酮-甲醇溶液），将氯化钠质量浓度调整至270 g/L，并用PTFE-silicone瓶盖密封。在45 ℃保温平衡20 min后，插入75 μm CAR/PDMS萃取头，并在45 ℃振荡萃取30 min。萃取后，在GC进样口（250 ℃）解吸3 min。萃取头首次使用时，需在270 ℃老化30 min；连续进样时，2 个样品之间萃取头需要在270 ℃老化10 min，以防止样品之间的相互污染。

1.3.2 GC-Orbitrap-MS检测条件

使用配备TriPlus RSH自动进样器和TRACE 1310气相色谱仪的Q Exactive GC-Orbitrap-MS进行分析。TraceGOLD TG-5SilMS毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；程序升温：40 ℃保持2 min，以5 ℃/min升至130 ℃，保持1 min，再以10 ℃/min升至250 ℃，保持5 min。载气为高纯氦气，流速1.0 mL/min，分流比20∶1，传输线温度250 ℃。质谱分辨率60 000（m/z200，FWHM），在电喷雾离子源（电子能量70 eV）下获得质谱，质量扫描范围m/z33～350 ，离子源温度280 ℃。

1.3.3 GC-LRMS检测条件

配备TriPlus RSH自动进样器和TRACE 1310气相色谱仪的四极杆GC-MS系统进行GC-MS和GC-O分析。TR-5MS毛细管色谱柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm）；程序升温：40 ℃保持5 min，以4 ℃/min升至120 ℃，保持2 min，再以7 ℃/min升至220 ℃，保持5 min。载气为高纯氦气，流速1.0 mL/min，分流比10∶1，传输线温度250 ℃。电子电离源，电子能量70 eV，质量扫描范围m/z33～350，离子源温度280 ℃。

1.3.4 GC-Q-MS-O检测条件

GC-MS检测条件同1.3.2节。GC-O实验中，色谱流出物以1∶1的分流模式分别流入质谱与嗅闻装置中，嗅闻仪输出端管线加热至280 ℃以防止流出物冷凝，并辅以水蒸气以避免人鼻黏膜脱水损害嗅觉灵敏度。

GC-O实验由5 名感官人员进行（2 名男性和3 名女性，年龄19～31 岁）。对感官人员进行2 次培训，一次利用香气单体标准品进行嗅闻培训，以增强感官人员对香气的印象及规范感官人员对香气特征的描述；一次对酱油香气样品进行GC-O实验，以适应GC-O分析程序及香气强度的判定（1=微弱的，可识别的味道；2=清晰，但不强烈的味道；3=强烈的味道；4=极其强烈的味道）。正式实验中每人重复嗅闻2 次，每次嗅闻时间约为30 min。感官评价人员在嗅闻过程中描述香气化合物的气味特征及强度。记录系统配备录音功能以记录感官人员的气味描述和评定的气味强度。

1.4 数据处理

GC-MS数据采用Xcalibur 2.0版（Thermo Finnigan）软件将质谱图与NIST 2017比对分析；GC-Orbitrap-MS数据采用Thermo Scientific TraceFinder（version 4.1）进行处理，对数据进行解卷积后再将质谱图与NIST 2017比对。通过谱库比对的正/反向匹配度和保留指数（retention index，RI），共同确证未知化合物的定性结果，高分辨质谱数据辅助以高分辨过滤分值和质量偏差判断定性结果。RI以C6～C33的系列正构烷烃在相同实验条件下计算得到。高分辨数据的元素组成推断由Thermo Scientific Qual Browser软件完成，质量精度小于3×10-6。

2 结果与分析

2.1 基于GC-Q-MS与GC-Orbitrap-MS测定酱油挥发性化合物的分类对比

图1 采用GC-Q-MS和GC-Orbitrap-MS检测酱油中挥发性化合物数量的对比Fig.1 Comparison of the numbers of volatile compounds detected in soy sauce by using GC-Q-MS and GC-Orbitrap-MS

如图1所示，通过GC-Q-MS与GC-Orbitrap-MS分别从酱油样品中鉴定出91 种和166 种挥发性化合物，其中GC-Orbitrap-MS对呋喃（酮）类、含硫化合物、杂环类以及酯类的检测数量都明显高于GC-Q-MS，分别比GC-Q-MS检出数量多15、10、8、8 个化合物；且GC-Orbitrap-MS检出化合物的总峰面积为GC-Q-MS总峰面积的31.1 倍。两者的差异可能是由于样品中这几大类化合物含量较低，但GC-Q-MS的检出限相对较高而无法定性分析引起，然而低含量并不影响其为食品贡献香气，因为往往这类物质香气阈值非常低[17-18]。如Song Xuebao等[19]发现苯甲硫醇和2-甲基-3-呋喃甲醇的阈值分别为0.01 μg/L和5.7×10-3μg/L，它们在白酒中的含量非常低，但仍显示出高于100的气味活性值，对白酒的整体香气有显著贡献。综上所述，GC-Orbitrap-MS高分辨数据容量大、灵敏度高的特点，使其在痕量低阈值物质的检出方面具有明显的优势，适合于未知气味活性化合物的挖掘。

2.2 GC-Q-MS-O分析酱油的气味活性化合物的难点

采用GC-Q-MS-O鉴定酱油的香气活性物质，并基于本团队多年酱油香气分析的经验，经过内部酱油香气谱库对比分析，最终仍有4 个强香气活性区域无法确定，RI如表1所示。未知物质1的RI为760，其前后分别检出2-甲基丙酸和甲苯，均与果香不相符，推测可能为酯类物质；RI为796的附近检出2-甲基-3-己酮、2,3-丁二醇，相关报道[4]中也在此处闻见“果香”，被鉴定为2,3-丁二醇，然而在进一步研究发现2,3-丁二醇的阈值较高，为150 mg/L，计算其气味活性值（发现并不相符，可能鉴定错误，因此RI为796标记为未知物质2。未知物质3（RI为829）前后分别检出甲基吡嗪、糠醛、3-甲基丁酸，均与“清香，草香”香气描述不相符。未知物质4（RI为1 119）被描述为“花果香”，此处附近检出苯乙醇、HEMF，苯乙醇峰面积较大，然而此处香气描述并不完全同于苯乙醇标准品的“花香”[20-21]，推测是2 个香气物质共流出导致，因此除了苯乙醇检出外，标记未知物质4。

表1 酱油中4 个“未知”香气活性区域的RI及香气特征Table 1 Retention indices and aroma characteristics of 4 “unknown”aroma-active compounds in soy sauce

2.3 GC-Orbitrap-MS辅助GC-Q-MS-O鉴定酱油的未知香气化合物

采用GC-Orbitrap-MS分析嗅闻样品，在未知物质RI附近进行重点分析，与GC-MS分析物质对比结果如表2所示，4 个目标“未知物质”的双质谱（GC-Q-MS和GCOrbitrap-MS）选择离子流图如图2所示。结果均表明GCOrbitrap-MS在关键香气活性区域附近相对GC-MS，均有新的物质检出。

表2 基于GC-Q-MS和GC-Orbitrap-MS谱图“未知”气味活性化合物分析Table 2 Analysis of four “unknown”aroma-active compounds by GC-Q-MS and GC-Orbitrap-MS

由表2可知，RI在760±10范围内，GC-Q-MS检出2 个物质，但GC-Orbitrap-MS检出3 个物质，其中新检出物质为异丁酸乙酯，符合RI和嗅闻结果，即该区域有“水果香”的香气特征[22-23]，且该酯类物质阈值非常低，仅为2.2×10-2μg/L[24]，因此在极低质量浓度也具有香气贡献，故GC-MS-O结果中未知物质1有很大可能是异丁酸乙酯。如图2a可知，根据GC-Orbitrap-MS鉴定结果，确定目标物质具有m/z88.051 9的特征碎片，然后在GC-MS谱图中提取同一碎片峰m/z88，放大谱图发现该峰处于2-甲基丙酸的峰尾覆盖处，质谱碎片交叉较多，难以分析解谱。由图2a可以明显发现，GC-MS与GC-Orbitrap-MS采用同一碎片提取，峰形显著改善，信噪比从89提高到3 993；随着进一步在Mass Tolerance 5 ppm模式下提取高分辨谱图离子信息，信噪比得到进一步的提升，达到5 541，表明高分辨质谱通过分辨率可以实现选择离子流图的低噪声，同样的样品在高分辨下可以获得更高的信噪比，更有助于未知香气物质的解析。

在RI为796处（未知物质2）其“水果香”风味特征与未知物质1（异丁酸乙酯）类似，GC-Orbitrap-MS数据表明，在该RI附近解析出3 个新物质，分别为2,4-二甲基-3-戊酮、2-乙基-5-甲基呋喃、丁酸乙酯（表2），其中丁酸乙酯RI和香气特征最为相符，文献风味描述为“水果味”、“酯味”[25-26]。

在RI为829±10范围内，未知物质3具有“青草，清香”的风味特征，GC-Orbitrap-MS在该区域比GC-Q-MS多检出1 个物质，为3-己烯-2-酮。Culleré等[27]在藏红花中曾检出3-己烯-2-酮，其气味描述词为“青草香”、“天竺葵”。

RI为1 119附近（未知物质4）被感官人员描述为“花果香”，GC-Orbitrap-MS除检出苯乙醇和HEMF外，还检测出1 个新物质——异佛尔酮。在之前的研究中异佛尔酮曾被描述为“果香”、“青草香”[28-29]，阈值为0.22 mg/L[30]，苯乙醇则具有“花香、甜香”的香气特征，且在GC-MS谱图提取异佛尔酮特征碎片m/z82后，发现为m/z82的色谱峰在苯乙醇高峰掩盖之下（图2d），因此花果香的描述很可能由于苯乙醇与异佛尔酮的共流出造成。

图2 未知香气物质的双质谱（GC-Q-MS和GC-Orbitrap-MS）联合解析Fig.2 Analysis of four unknown odorants by combined use of GC-QMS and GC-Orbitrap-MS

GC-Q-MS在定性分析，主要依赖于与NIST谱库比对的结果（正/反向匹配度）和RI，当待测化合物浓度极低（图2a～c），或者共流出峰有严重干扰时（图2d，异佛尔酮与苯乙醇共流出），往往难以获得良好的谱库匹配结果。即使经验丰富的感官人员通过准确的气味描述，在文献中找到合理的怀疑对象，也只能勉强通过提取离子流图，找到个别可能存在的碎片（图2），最终确认定性结果仍需依靠标准品的核对。

表3 基于GC-Orbitrap-MS的“未知”气味活性化合物定性分析Table 3 Qualitative analysis of four “unknown”aroma-active compounds by GC-Orbitrap-MS

高分辨质谱能够获得高信噪比，提高谱库检索正/反向匹配度值，还可以提供化合物的准确元素组成。确定元素组成步骤如下：1）通过精确质量数计算得到候选化学式组成；2）计算化学式组成的理论天然同位素分布比例，与实际测比例进行比较，排除错误的化学式[32]。GC-Orbitrap-MS由于静电场轨道阱的设计，同时兼有高分辨率和高灵敏度等优势[32]，能够准确检出并区分痕量天然同位素峰，如丁酸乙酯中的碎片m/z61.028 4（C2H5O2＋）和m/z61.023 9（C13CH4O2），高质量精度（质量偏差＜1×10-6）的数据能够更精确地推断化合物的结构。经过解卷积处理的GC-Orbitrap-MS数据首先通过与NIST谱库的比对，从而获得候选的化合物信息，然后软件根据候选化合物的元素组成限定，推算电子电离源质谱图下每个碎片可能的化学式，以碎片化学式的理论m/z与实测m/z进行比较，最终以高分辨过滤分值的形式呈现出高分辨判定结果，高分辨过滤分值越接近100，表明化合物的可信度越高[33]。

如表3所示，以异丁酸乙酯为例，由于受到共流出干扰，该化合物与NIST谱库匹配的正向匹配度仅有659，但高分辨过滤分值为100，而且质谱图中可以明显找到异丁酸乙酯的分子离子峰m/z116.083 17（理论值m/z116.083 18，质量偏差0.096×10-6），以及分子离子峰的13C同位素峰m/z117.086 51（m/z理论值117.086 54，质量偏差0.222×10-6），该天然同位素碎片的理论占比为6.49%，实测占比6.14%，因此可以确认m/z116.083 17碎片的化学式为C6H12O2。GC-MS在电子电离源下可以获得丰富的碎片离子信息，通过对化合物主要离子碎片的结构推算，最终可以鉴定RI为760的化合物为异丁酸乙酯。同理可将RI分别为796、829、1 119鉴定为丁酸乙酯、3-己烯-2-酮和异佛尔酮。

3 结 论

相对GC-Q-MS检测，高分辨GC-Orbitrap-MS灵敏度优势突出，2 种质谱检测器分别从酱油中鉴定出91 种和166 种挥发性化合物，高分辨数据总峰面积是低分辨的31.1 倍。在GC-MS-O实验中，有4 个香气活性区域分别描述为“果香”、“果香”、“清香，草香”、“花果香”，但在GC-Q-MS上未能准确定性。本实验利用GC-Orbitrap-MS，在NIST谱库比对、RI及香气特征等常规信息基础上，采用高质量精度的质谱数据推算化合物及其天然同位素组成，全面定性了4 个未知香气活性物质，分别为异丁酸乙酯、丁酸乙酯、3-己烯-2-酮和异佛尔酮。实验证明，GC-Orbitrap-MS能够有效辅助GC-QMS-O鉴定酱油中未知的气味活性化合物，这对于酱油中香气化合物的研究有重要的推动作用，为建立酱油全面的香气模型提供理论依据。不仅如此，该方法适用于鉴定食品的未知气味活性化合物，对于食品风味化学研究有着重要意义。考虑到固相微萃取法香气鉴定具有选择性，下一阶段将进一步研究该法基于液液萃取及溶剂辅助蒸馏萃取法的应用效果。