乌头类药材及其中成药乌头碱类化合物的含量测定*

徐 冰 张玉修 曹胜男 孙建楠△

(1济宁医学院公共卫生学院，济宁 272013；2济宁市中医院，济宁 272027)

乌头碱，新乌头碱等二萜类生物碱是乌头类药材的主要的药效成分，具有镇痛消炎的良好功效[1-4]，但毒性很强，用药不当易造成中毒[5]。经炮制后，其中的乌头碱类化合物可转化为单酯型生物碱，单酯型生物碱具有良好的药理活性，且毒性远远低于双酯型生物碱[6]，所以乌头类药材常不直接药用，而是将其炮制之后降低毒性。

目前，中成药乌头碱类成分的检测主要使用高效液相色谱法[7-10]。该方法检测灵敏度高，对于微量检测有着重要作用；重复性好，应用广泛，常用于大批量检测。本实验采用超声提取结合高效液相色谱法方法，对市售乌头类中药和中成药中的乌头碱类物质进行测定，为安全用药提供依据和参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器

SHIMADZU LC-2OAT双泵高效治相色谱仪(日本鸟津公司)；GZY-P20-B超纯水仪(湖南科尔顿水务有限公司)；FA2104N电子天平(上海菁海仪器有限公司)；FW-100高速万能粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)；SB25-12DTD超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司)。

1.2 试剂及样品

乌头碱对照品(批号140303，北京恒元天启标准品有限公司)；新乌头碱对照品(批号AB664W，天津一方科技有限公司)；川乌，附子(济宁广联医药公司)，附子理中丸(批号19013455、18011765，北京同仁堂科技发展股份有限公司制药厂)，桂附地黄丸(批号190313、181201，北京同仁堂科技发展股份有限公司制药厂)，伤湿止痛膏(批号191209、181101，湖南杏林春药业有限公司)。

2 方法与结果

2.1 乌头碱、新乌头碱的提取

2.1.1标准品储备液制备 准确称取乌头碱和新乌头碱固体标准品，以甲醇作为溶剂，溶解、定容至10ml，制得浓度分别为3.8μg/ml和5.6μg/ml的乌头碱和新乌头碱标准储备液。

2.1.2样品处理 根据药材和中成药不同的形态分别处理。附子和川乌为块状干药材，直接用粉碎机粉碎，全部过60目筛备用；附子理中丸为大蜜丸，将其剪碎，研钵研细备用；桂附地黄丸为黑棕色浓缩丸，研钵研细备用；伤湿止痛膏为片状橡胶膏，除去盖衬，剪成小块备用。

2.1.3供试液的制备 取按照2.1.2项处理的样品2g左右，精密称定，置锥形瓶中，加入25ml pH=2的盐酸水溶液，确保没过样品上端，用保鲜膜封住锥形瓶口防止溶剂在超声过程中挥发，于25 ℃下超声60min，对提取液进行过滤，过滤后弃去固体，滤液室温(30 ℃)下过夜挥至近干，残渣以流动相比例混合溶液复溶至2ml，用于随后的HPLC分析。

2.1.4影响萃取效率的单因素实验 为了获得最佳萃取效率，本实验以附子样品为基质，对可能影响萃取效率的多个因素，包括提取溶剂的种类、超声时间和超声温度等进行了优化，确定了最佳的提取条件。

1)提取溶液。本研究分别用甲醇、乙腈、pH=2的盐酸水溶液、pH=10的三乙胺水溶液进行超声提取，控制超声时间为45min，超声温度为25℃，酸性条件下提取效果最优。见图1。

图1 提取溶剂的优化

2)超声时间。超声时间会影响萃取效率，本实验分别考察了超声15min、30min、45min、60min时的萃取效率，提取效果随着超声时间的延长而增加[11]，结果显示为60min为最优超声时间。见图2。

图2 超声时间的优化

3)提取温度。本实验探究了提取温度对萃取效率的影响。结果表明，25℃为最佳提取温度(见图3)。这可归因于待测物质对热不稳定，超声温度过高易导致分解[12]。

图3 提取温度的优化

2.2 乌头碱、新乌头碱含量的测定

2.2.1测定波长的选择 以标准溶液进液相分析，以SPD-M20A检测器对乌头碱和新乌头碱在200～700 nm范围内进行全波段扫描，发现乌头碱(图4a)和新乌头碱(图4b)均在196nm、230nm处出现两个较大吸收峰，考虑到196nm处产生紫外吸收的物质较多，易对样品测定产生较大基质干扰，最终选择230nm为乌头碱和新乌头碱的检测波长。

图4 乌头碱和新乌头碱标准溶液紫外-可见光谱扫描图

2.2.2色谱条件的优化 仅以标准溶液进样时，乙腈和0.03%三乙胺水溶液(pH=8)以体积比85∶15(v/v)的混合溶液能将新乌头碱与乌头碱二者较好地分离。但应用于实际样品时，因中药材成分复杂，分离效果不理想。因此更换流动相比例，选择乙腈和0.03%三乙胺水溶液(pH=8)以体积比60∶40(v/v)的混合溶液为流动相时，样品能实现较好的分离。见图5、6。

注：1为新乌头碱，2为乌头碱

注：1为新乌头碱，2为乌头碱

2.2.3检出限和线性关系考察 吸取乌头碱、新乌头碱浓度分别为3.8μg/ml、5.6μg/ml的混合标准溶液，稀释至合适浓度，按照1.1色谱条件上机测定，以三倍信噪比所对应的浓度为检出限。见表1。

以甲醇为溶剂，分别配制乌头碱浓度为3.8μg/ml,7.6μg/ml,15.2μg/ml,30.4μg/ml,60.8μg/ml，新乌头碱浓度为5.6μg/ml,11.2μg/ml,22.4μg/ml,44.8μg/ml,89.6μg/ml的混合标准溶液。以1.1描述的仪器条件进HPLC检测，记录峰面积。以标准品的浓度为横坐标(μg/ml)，以峰面积为纵坐标，得到线性方程(表1)。

表1 检出限及线性关系

2.2.4日内精密度 吸取乌头碱浓度为15.2μg/ml，新乌头碱浓度为22.4μg/ml的混合标准溶液10μl，在24h内，每隔1h进样1次，连续进样6次，计算6次峰面积的平均值及RSD值。见表2。

2.2.5日间精密度 选取配制好的乌头碱浓度为3.8μg/ml，新乌头碱浓度为5.6μg/ml的混合标准溶液，两星期内选取3d，每天平行测定3次，计算三日峰面积的平均值及RSD值，见表2。

表2 精密度

2.2.6稳定性 取按照2.1.3制备的桂附地黄丸样品供试液，按照确定的色谱条件，分别在0、2、4、6、8、10、12、24h测定各成分的峰面积，记录各化合物的峰面积并计算相对标准偏差。乌头碱和新乌头碱峰面积的RSD值为4.8%和4.5%。供试液可在1d内保持基本稳定。

2.2.7重复性 取5份同一批次桂附地黄丸样品，按照2.1.3方法制备供试液，将供试液进HPLC分析，记录峰面积并计算RSD值。乌头碱和新乌头碱峰面积的RSD值分别为4.6%和4.2%。

2.2.8加标回收率 依据桂附地黄丸(批号181201)中乌头碱和新乌头碱含量的80%，100%，120%，加适量对照品到桂附地黄丸样品中，按照2.1.2和2.1.3的步骤进行提取，每个样品平行进样3次，计算加标回收率。乌头碱和新乌头碱在低、中、高3个浓度范围内，加标回收率均控制在99.84%～103.28%，该方法准确可靠。见表3。

表3 加标回收率

2.2.9实际样品分析 将购买的川乌和附子两种中药，两个批次的3种常见含附子类药材的中成药，按照样品处理步骤处理后，进HPLC分析，每个样品测定3次，利用3次峰面积平均值计算每种药物中乌头碱和新乌头碱的含量，检测结果如表4、5所示。

表4 中药材中乌头碱及新乌头碱测定结果(μg/g)

表5 中成药中乌头碱及新乌头碱测定结果(μg/g)

2.3 用药安全分析

查阅《中华人民共和国药典》(2015版)可知，制川乌中所允许存在的双酯型生物碱最大浓度为0.40mg/g，根据小鼠灌胃的LD50推算，双酯型生物碱LD50为1.01mg/kg，若以一个60kg体重的成年人的服用剂量计算，结果显示附子理中丸、桂附地黄丸未超过服用计量；通过伤湿止痛膏摄入的乌头碱含量也低于LD50的剂量，但是没有经过炮制的川乌、附子含量较高，不宜直接服用。

3 结论

本实验建立的超声提取结合高效液相色谱法，能准确测定原药材和相关中成药中乌头碱与新乌含量。所建立的方法准确、高效、可靠，可为中成药类的用药安全和质量评估提供依据和参考。