蒙古扁桃石油醚提取物对博来霉素诱导大鼠肺纤维化的治疗作用*

王艳国，周红兵，郝海梅，吴 桐，常 虹，石松利,2

(1.内蒙古科技大学包头医学院，内蒙古 包头 014060；2.内蒙古科技大学包头医学院蒙中药活性物质与功能研究所)

肺纤维化(Pulmonary fibrosis)亦称间质性肺病，是由多种弥慢性肺间质疾病引起的病理改变，亦是对肺损伤过度修复的结果，晚期多引起心、肺功能衰竭以及呼吸衰竭而导致死亡，成为呼吸系统的难治疾病，严重危害人类健康[1]。近年来，随着空气污染以及不良生活习惯的影响，肺纤维化发病率逐年递增，但尚无理想药物和治疗方法，为此寻找能够治疗肺纤维化的药物具有十分重要的意义。

蒙古扁桃(Amygdalus mongolica)，蒙名乌兰-布衣勒斯，为蒙古高原特有的阿拉善荒漠种，蔷薇科扁桃属旱生落叶灌木[2-3]。作为一种传统中蒙药可代“郁李仁”以种仁入药，具有治疗咽喉干燥、干咳及支气管炎的作用[4-5]。课题组郑倩男等[6-8]前期研究表明蒙古扁桃石油醚提取物能有效调节血脂水平，具有抗氧化和保肝的作用。吴桐等[9-10]研究表明蒙古扁桃石油醚提取物对治疗四氯化碳所导致的大鼠肝纤维化效果较好。贾小叶等[11]研究表明蒙古扁桃药材石油醚部位可以发挥抗大鼠肾纤维化的作用。同时有研究表明中医药对肺纤维化有较好的治疗效果[12]。因此基于蒙古扁桃的传统药理作用，本实验在课题组前期研究的基础上，利用博莱霉素诱导的大鼠肺纤维化模型，探讨蒙古扁桃石油醚提取物对博来霉素诱导的大鼠肺纤维化的治疗作用。

1 对象与方法

1.1药物与动物 蒙古扁桃，采自阿拉善雅布来戈壁，经包头医学院石松利教授鉴定为蒙古扁桃药材干燥成熟种子；注射用盐酸博来霉素(批号：540402)，购自日本化药株式会社；醋酸泼尼松片(批号：140905)，购自浙江仙琚制药股份有限公司；60只SPF级雄性SD大鼠，体质量(180±20)g，购自北京大学医学部(实验动物科学部)，许可证号SCXK(京)2011-0012。于室温(25±2)℃，相对湿度(50±5)%条件下饲养。

1.2试剂与仪器 MDA试剂盒(批号：20150421)、SOD试剂盒(批号：20150505)、HYP试剂盒(批号：20150527)、总蛋白定量测定试剂盒(批号：20150519)，均购自南京建成生物工程研究所；DZW-8-8型水浴锅(北京市永光明医疗仪器厂)；RE-52A型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；MH-250型电热套(北京科伟永兴仪器有限公司)；TGL-16M型高速台式冷冻离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)；CX31显微镜(日本奥林巴斯公司)。

1.3方法

1.3.1蒙古扁桃石油醚提取物的制备 蒙古扁桃种子去壳洗净后搅碎成颗粒，在料液比1∶10的条件下运用索氏提取法，分别采用95 %、50 %乙醇水浴回流，得到粗提液后回收溶剂，使药液呈浸膏状。将浸膏以石油醚为溶剂萃取，并减压浓缩萃取物，即得蒙古扁桃石油醚提取物，得率为13.7 %。按给药组高、中、低剂量1.75 g/kg、1.25 g/kg、0.75 g/kg，用0.5 %羧甲基纤维素钠将蒙古扁桃石油醚提取物配制成浓度为0.024 g/mL的溶液。大鼠高、中、低剂量组给药剂量分别为10 mL/kg、7.14 mL/kg、4.28 mL/kg，所有灌胃药液均置于4 ℃冰箱中保存。

1.3.2动物分组与用药 60只SD大鼠适应性饲养至体重为(300±20)g时，按体重随机分为对照组、模型组、阳性药强的松组、蒙古扁桃石油醚提取物高剂量组、中剂量组、低剂量组，每组10只。

1.3.3实验动物模型建立 用1 %水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔内注射麻醉，将大鼠仰卧固定于实验台，开口器固定口腔，拉出舌，用压舌板压舌腹，在额镜直视下，趁动物吸气瞬间迅速进行气管插管(52 mm,4～5 cm)，动物模型组大鼠按5 mL/kg缓慢注入1 mg/mL的博来霉素，之后立即旋转摇晃大鼠，使药液在肺内均匀分布[13-14]。各组于造模24 h后灌胃给药，1次/d，连续灌胃4周。

1.3.4标本采集 于造模后第28 d处死大鼠，用10 %水合氯醛根据大鼠体重进行腹腔注射麻醉后，使其处于仰卧位，打开腹腔，取腹主动脉血以及肺、心组织并称重(测定肺、心脏器系数)；将肺组织切块分装，用液氮速冻后于-80℃冰箱中保存(后期进行HE、Masson染色及测定组织HYP)。采集腹主动脉血于4 ℃、以6 000转/min冷冻离心10 min，分离血清，用液氮速冻后于-80 ℃冰箱中保存(检测血清SOD、MDA)。

2 结果

2.1大鼠一般状况 对照组大鼠活泼好动，食量大，体型肥硕，皮毛光泽，体重逐渐增加，呼吸平稳；模型组精神不振，行动迟缓，拱背蜷缩，皮毛枯槁、无光泽，身体较其它组消瘦，呼吸急促、有咳喘现象。蒙古扁桃石油醚提取物不同剂量组和阳性药强的松组灌胃治疗1周后大鼠状态有所好转，食量增大，体重逐渐增加且拱背蜷缩减轻。

2.2蒙古扁桃石油醚提取物对肺纤维化大鼠肺、心系数的影响 如图1所示，与假手术组相比，模型组大鼠肺、心系数升高(P<0.05)；与模型组相比，蒙古扁桃石油醚提取物低剂量组大鼠肺系数降低，高、低剂量组与阳性药组均能降低大鼠心系数(P<0.05)。

2.3蒙古扁桃石油醚提取物对肺纤维化大鼠肺病理组织学的影响

2.3.1大鼠肺组织HE染色 结果显示假手术组大鼠肺组织肺内结构清晰，肺泡间隔未见增厚；模型组大鼠肺组织肺泡间隔明显增厚，肺泡结构消失，广泛的纤维灶形成；蒙古扁桃各给药组与阳性药组肺泡结构清晰，肺纤维化程度较模型组减轻，见图2。

2.3.2Masson染色 镜下观察所见假手术组为正常肺组织结构，仅小部分肺泡周围或支气管壁轻微增厚；模型组肺组织可见全视野纤维化改变；蒙古扁桃各给药组肺泡或支气管壁中度增厚，部分肺泡结构遭到破坏，有小范围纤维灶形成，肺纤维化程度较模型组减轻，见图3。

2.4蒙古扁桃石油醚提取物对肺纤维化大鼠肺组织中HYP的影响 如图4所示，与假手术组相比，模型组肺组织HYP含量增高，差异具有统计学意义(P<0.05)；与模型组相比，蒙古扁桃石油醚提取物高、低剂量组能降低肺组织HYP含量(P<0.05)。

2.5蒙古扁桃石油醚提取物对肺纤维化大鼠血清SOD，MDA的影响 如图5所示，与假手术组相比，模型组大鼠的血清SOD下降，MDA增高(P<0.05)；与模型组大鼠相比，蒙古扁桃石油醚提取物高、中、低剂量组与阳性药组均能提高血清SOD，降低血清MDA含量(P<0.05)。

3 讨论

一次性气管内灌注博来霉素诱导的动物肺纤维化模型是目前国内外常用、受认可的肺纤维化造模方法[15]。本实验利用该模型探究蒙古扁桃石油醚提取物对肺纤维化这一具体病理改变的治疗作用。课题组前期实验中对蒙古扁桃石油醚提取物降血脂作用进行了量效关系确定，设置生药量为0.1875 g/kg、0.375 g/kg、0.75 g/kg、1.5 g/kg、3.0 g/kg的不同实验剂量组，结果显示其降血脂作用的有效剂量范围是(0.5～1.5)g/kg。进一步实验表明，蒙古扁桃石油醚提取物在生药量(0.75～1.5)g/kg对肝纤维化大鼠肝脏具有一定保护作用，依据器官纤维化异病同治的研究思路，本次实验选取0.75 g/kg、1.25 g/kg、1.75 g/kg的生药剂量[9]。

肺系数是反应肺纤维化程度的指标之一，其高低与肺重量和体重密切相关，其中肺重量增加是肺系数增大的主要原因。长期肺纤维化改变会引起呼吸衰竭，导致一定程度的血氧分压下降和二氧化碳分压上升，从而引起反射性心率加快、心肌收缩能力增强及心排出量增加，最终导致心脏增大，从而心系数增大。本研究结果显示蒙古扁桃石油醚提取物低剂量组能降低大鼠肺、心系数；高剂量组能降低大鼠心系数，说明蒙古扁桃石油醚提取物具有一定的对抗博莱霉素致大鼠肺损伤的作用。HYP是胶原蛋白的组成成分，约占其氨基酸总量的13.4 %，通过对肺组织中HYP含量的测定可以了解其胶原蛋白分解代谢情况，其含量可间接反映组织纤维化程度[16]。SOD可抑制自由基启动的脂质过氧化，其活力的高低对机体清除自由基和抗脂质过氧化能力有着间接反应[17]。MDA是脂质过氧化的最终产物，其含量高低体现机体脂质过氧化程度[18]。研究结果表明，蒙古扁桃石油醚提取物低剂量组可降低血清MDA以及肺组织HYP水平，提高血清SOD含量；蒙古扁桃石油醚提取物中剂量组可降低大鼠血清MDA含量，提高血清SOD含量；蒙古扁桃石油醚提取物高剂量组可降低大鼠血清MDA及肺组织HYP水平，提高血清SOD含量。提示蒙古扁桃石油醚提取物具有清除活性氧，提高机体抗氧化能力以及抗脂质过氧化的作用，从而达到抗肺纤维化的目的。

综上所述，蒙古扁桃石油醚提取物具有较好的抗肺纤维化作用，实验结果为蒙古扁桃药用价值的进一步开发与利用提供了一定的实验基础与研究依据。