无定形磷酸钙在不同介质中的稳定性研究

樊鸿星，吴 刚

(内蒙古科技大学包头医学院基础医学与法医学院，内蒙古 包头 014040)

骨和牙的主要无机成分为磷酸钙盐，其成分和结构接近羟基磷灰石[Hydroxyapatite，HAP，Ca10(PO4)6(OH)2]，而无定形磷酸钙[Amorphous calcium phosphate，ACP，Ca3(PO4)2]被认为是骨矿化过程的前驱体，无定形磷酸钙最早是人们在用湿法合成羟基磷灰石时发现[1]。ACP在水相中难以稳定存在，过饱和的钙磷溶液互相混合时，ACP是最先产生的固相，随后逐渐向热力学稳定的HAP转变。ACP在潮湿环境中能迅速转化为HAP，其寿命长短与反应系统的pH值、溶液离子强度、温度、外加离子及生物大分子等密切相关。随着现代科学不断发展，多项研究已证明ACP在各种生物体中广泛存在。在正常生理状态下，存在于生物介质如血液、细胞外液和细胞培养基中的钙离子和磷酸根离子浓度已经处于过饱和状态，其离子积远大于溶度积，有较强的自发生成磷酸钙盐的趋势。但是生物介质中并未产生磷酸钙盐的沉积，这是因为在血清中存在一些抑制磷酸钙盐沉淀生成的因子，如胎球蛋白A、基质Gla蛋白、骨保护素以及焦磷酸盐等，它们与磷酸钙盐微粒相结合，阻止微粒形成、长大和聚集，在生物介质中的化学行为不同于单纯的水溶液状态[2-5]。在脊椎动物骨骼和牙齿的矿化过程中发现存在着大量ACP[6]。ACP的合成方法有多种，大致分为湿法和干法两大类。湿法是在纯水系统、非水系统或者溶剂-水的二元系统中，将钙磷溶液混合制备。干法合成是在低温下离子溅射合成ACP或将熔融状态的磷酸钙材料(CaPs)迅速猝灭。本研究采用湿法制备，探究ACP在纯水和大鼠血清两种不同系统中的差异。

1 对象与方法

1.1实验动物 无特定病原体(Specific pathogen free，SPF)级健康SD雄性大鼠20只，体质量160～180 g。北京维通利华实验动物技术有限公司提供，实验动物质量合格证明书编号：SCXK(京)2016-0006。

1.2试剂和仪器 二水氯化钙(CaCl2·2H2O，美国Sigma公司)、磷酸二氢钠(NaH2PO4，美国Sigma公司)、氢氧化钠(NaOH，北京化工厂)、盐酸(HCl分析纯，北京化工厂)、无水乙醚(Diethyl ether，北京市通广精细化工公司)、75 %乙醇消毒液(Ethanol 75 %，山东利尔康消毒科技有限公司)。电子天平(AL104，瑞士梅特勒-托利多公司)、超纯水仪(Aquaprince，重庆颐洋企业发展有限公司)、水浴恒温槽(SDC-6，宁波新芝生物科技股份有限公司)、Seven多功能测定仪(S470-K，瑞士梅特勒-托利多公司)、高速离心机(HC-3018，安徽中科中佳科学仪器有限公司)、快速混匀器-MX-F，大龙兴创实验仪器(北京)有限公司。同步辐射XANES装置(中科院北京高能物理研究所)。

1.3实验方法

1.3.1制备大鼠血清 使大鼠吸入适量乙醚进入麻醉状态。剪掉大鼠胡须，将眼眶周围擦拭干净以减少溶血风险。左手抓住大鼠颈部皮肤，轻压在实验台上，取侧卧位，且左手食指尽量将大鼠眼周皮肤往颈后压，使眼球突出。右手使用已消毒的眼科弯镊迅速夹去眼球，将大鼠倒立，用准备好的5 mL离心管接住流出的血液。室温静置15～30 min后，1 500 g转速离心15 min。取出后观察血清颜色，弃去溶血样本，取淡黄色上清液即为实验所需血清样本。

1.3.2监测水溶液Ca2+浓度和pH值变化 在50 mL烧杯中加入CaCl2溶液(10 mmol/L)10 mL，水浴恒温25 ℃，再加入等体积的NaH2PO4溶液(10 mmol/L)，开始搅拌，并且使混合溶液的初始pH值在7.30～7.35之间，连续1 h监测Ca2+浓度和pH值的变化并做好记录。

1.3.3监测大鼠血清Ca2+浓度和pH值变化 在5 mL离心管中加入CaCl2溶液(20 mmol/L)2.5 mL，再加入等体积的NaH2PO4溶液(20 mmol/L)，快速混匀，5 000 g转速离心2 min，快速弃去上清液，将沉淀物加入水浴恒温25 ℃的10 mL等体积混合的大鼠血清中，混匀并且调整pH初始值在7.30～7.35之间，连续1 h监测Ca2+浓度和pH值的变化并做好记录。

1.3.4ACP转变为HAP 将制备的ACP添加到血清中混匀，取样。使用同步辐射装置测近边光谱。待恒温3 h后，再取样，同样测其近边光谱。考察血清中ACP的存在状态。

2 结果

2.1水溶液检测情况 (1)Ca2+浓度的变化：在反应温度恒定，初始pH值一致的条件下，可以看到水溶液中Ca2+浓度短时间快速降低，然后经过15 min的平台区，称为诱导期；随后快速降低，称为突降期；最后进入一段稳定期，如图1所示。(2)pH的变化：在水溶液中，pH值同样经过诱导期、突降期和稳定期，如图2所示。

2.2血清中CAP与HAP的分析 同步辐射测定光谱结果显示：在大鼠血清添加现合成的无定形磷酸钙(ACP)的吸收曲线与添加羟基磷灰石(HAP)的吸收曲线，如图3所示。恒温3 h后，吸收曲线几乎完全重合，如图4所示。由此证明ACP已经完全转化为HAP，说明在生物介质中，经过足够长的时间后，ACP也将转化成更稳定的HAP。

2.3血清的检测情况 (1)Ca2+浓度的变化:在血清中，Ca2+浓度持续缓慢上升一段时间，最后逐渐稳定，如图5所示。(2)pH的变化:在血清中，pH值几乎是呈持续增长趋势，但是在后期涨幅逐渐趋于稳定,如图6所示。

3 讨论

本研究结果显示,水溶液中Ca2+浓度开始时有短暂的降低(图1)，主要因为初始加入NaH2PO4溶液时，反应体系内短时间发生的反应并未达到稳定，所以在前1～2 min内，Ca2+浓度会出现明显下降。这一过程中H2PO4-释放一个H+变为HPO42-，HPO42-进一步与Ca2+结合形成CaHPO4，因此Ca2+出现一个明显的下降过程。在此过程中Ca2+与HPO42-的浓度达到CaHPO4的溶度积，首先形成CaHPO4，pH值随着H+的释放不断下降。当Ca2+与HPO42-全部转化为CaHPO4时，Ca2+浓度处于第一个平台区。随着HPO42-进一步解离一个H+，HPO42-转化为PO43-，PO43-与Ca2+形成Ca3(PO4)2，Ca2+浓度再次下降，并且pH值随着H+的进一步释放，有明显的下降过程(图2)，H2PO4-转化为PO43-，释放两个H+。图1和图2对比可知，在同一种反应系统中，Ca2+浓度和pH值的变化趋势一致。Ca2+完全形成Ca3(PO4)2后Ca2+浓度下降不明显，并逐步趋于稳定，pH值也将趋于稳定，进入第二个平台区。但Ca3(PO4)2(ACP)无定形沉淀不稳定，逐步会演变为Ca10(PO4)6(OH)2(HAP)，Ca/P比值将发生变化，由4.5/3演变为5/3，Ca2+浓度下降，但过程极其缓慢，完全转化为Ca10(PO4)6(OH)2后，Ca2+浓度趋于稳定。在纯水系统中，诱导期就是形成ACP的过程，突降期是ACP转变为HAP的过程，最终形成稳定的HAP。从突降期开始到最终变化稳定大约需要5～7 min。Ca3(PO4)2(ACP)无定形沉淀不稳定，逐步会演变为Ca10(PO4)6(OH)2(HAP)的相关研究已经有较多文献报道。

为了进一步明确在血清体系中ACP是否也最终转变为HAP，本研究采用同步辐射装置测其X-射线吸收近边结构，观察在血清体系中ACP是否转变为HAP。如图3和图4所示，在大鼠血清中分别添加ACP和HAP后，立刻利用同步辐射装置进行光谱测定，ACP和HAP光谱曲线明显不同，血清添加ACP后检测到了ACP的特征峰(*Energy4047处)(图3)。在恒温放置3 h后，ACP光谱曲线与HAP光谱曲线几乎完全重合，ACP特征峰消失，说明在大鼠血清体系中Ca3(PO4)2(ACP)无定形沉淀也不稳定，在一定时间下，也将逐步演变为Ca10(PO4)6(OH)2(HAP)。

在大鼠血清系统的研究中，加入ACP后会发生沉淀的解离。随着沉淀的解离，Ca2+浓度逐渐升高(图5)，达到解离平衡时Ca2+浓度稳定，处于平台区。解离出来的PO43-结合H+转化为HPO42-，H+浓度逐步下降，pH值逐步升高，达到沉淀解离平衡时pH值也逐步稳定，形成PO43-/HPO42-缓冲体系。从加入ACP到其变化为HAP基本稳定时大约需要37 min，由此可以证明在血清作为介质时，ACP转变为HAP需要的时间更长，ACP的稳定性比在纯水系统中更高，因为血清胎球蛋白A和白蛋白具有抑制颗粒物产生和增大的作用[7,3]。从图5中可以发现随着时间的变化，Ca2+浓度逐渐增加，由于ACP在血清中被稀释，聚集的磷酸钙簇分散开，才会使其发生解离，钙离子逐渐增多。最后趋于稳定是由于实验系统中的血清蛋白含量有限所致，且血清蛋白具有一定抑制作用。由图5和图6对比可知在生物介质中，Ca2+浓度和pH值的变化趋势一致。大鼠血清系统中关于血清蛋白在磷酸钙盐结晶过程中作用的相关研究较少，目前认为血清蛋白对磷酸钙盐的生成和聚集有抑制作用[8-10]。

无定形磷酸钙(ACP)是在结晶过程初期出现的一种亚稳态前驱相，其结构和性质都取决于构成它的离子簇。由于离子簇尺寸小、化学性质不稳定，在检测方面受到许多限制。近几年，离子簇的研究方法大多数以原位检测为主，这样可以跟踪检测溶液中真实发生的化学变化，同时不会对反应造成影响，能够直观、实时的进行动态观察[11-12]。本研究采用同步辐射装置测其X-射线吸收近边结构，它是吸收光谱的一种类型，反映了吸收边的边前区(-20 ev)至吸收边后50 ev部分的吸收特性，它是由激发光电子受周围原子的多重散射造成的，不仅能反映中心吸收原子的配位化学环境，还能反映低能位电子态的结构。经过近20年的发展，目前已获得了广泛应用。