慢性HBV感染患者核苷类药物治疗后相应突变位点检测及效果分析

张永荣

【摘 要】 目的：探析慢性HBV感染患者核苷类药物治疗后相应突变位点检测方法及效果情况。方法：选取慢性HBV患者207例，实施实时荧光定量PCR方法扩增其血清HBV多聚酶区，并直接测序PCR产物。结果：8例经ETV治疗患者，共发生突变类型2种，最为常见的为rtT184A/G/I/S;66例经ADV治疗患者，共发生突变类型3种，最为常见的为rtA181V/T/S;5例LdT治疗患者，共发生突变类型2种，最为常见的为rt M204I;128例LAM治疗患者中，共发生突变类型4种，最为常见的为rtV207I/L/G。结论：多样化为核苷类四五耐药株的氨基酸突变特点，根据基因型耐药检测结果，待抗病毒失败后对药物给予及时更换。

【关键词】 核苷类似物;慢性HBV感染;相应突变位点;效果分析

【中图分类号】 R512.6   【文献标志码】A   【文章编号】1005-0019（2020）17-221-01  本研究以我院接收的慢性HBV感染患者207例为研究对象，探究核苷类药物治疗后相应突变位点检测情况，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2016年3月-2019年9月收治患者207例，男162例，女45例;（19-81）岁，平均（48.6±3.5）岁。根据《慢性乙型肝炎防治指南》标准均已确诊。检测前，分别实施LdT、ADV、ETV和LAM等核苷类药物进行抗乙肝病毒治疗。前一晚禁食，翌日取适量静脉血为标本。

1.2 基因测序方法

1.2.1 定量PCR扩增 真空下取3ml血液为标本，离心取50μl血清，加入浓缩提取液50μl，震荡混匀后，在4℃的环境下静置五分钟，每分钟15000r，在4℃环境下离心十分钟，吸弃上清，加入裂解缓冲液40μl，剧烈震荡无沉淀后，予短暂离心，在100℃高温下加热十分钟，15000rpm，在4℃环境下离心五分钟，取4μl上清置于25μl反应体系中。94℃五分钟，94℃7秒、60℃50秒、40个循环，37℃恒温保存。

1.2.2 酶解PCR产物 取3μl PCR酶解产物，加入SPA混合物2μl，并将其混合均匀。在37℃下放置1小时，在80℃下防止15分钟，最后在4℃下保存。

1.2.3 PCR反应预测 取3μl PCR酶解產物，测序产物2μl与测序试剂1μl实施PCR扩增，96℃1分钟，96℃10秒、50℃5秒、60℃4分钟、循环25次，在4℃恒温状态下保存。

1.2.4 产物纯化的测序 （1）将醋酸钠-乙醇混合物16μl置于离心管0.2ml内，剧烈振荡，避光静置15分钟，按照每分钟12000r速度离心，在4℃环境下离心半小时，将上层液体吸弃。（2）将70%预冷乙醇70μl置于离心管0.2ml内，剧烈震荡，按照每分钟12000r速度离心，在4℃环境下离心15分钟，把上层液体吸弃。（3）将70%乙醇70μl置于离心管0.2ml内，温和颠倒数次混匀，按照每分钟12000r速度离心，在4℃环境下离心5分钟，把上层液体吸弃。（4）在室温下待酒精挥发干净后，将Hi-Di Formamide溶解DNA 10μl加入。（5）在PCR以上变性：在94℃环境下4分钟，在4℃环境下4分钟。上机进行电泳检测分析。

1.3 统计学方法 采用SPSS22.0软件统计工具，对研究中涉及的数据进行处理。计数数据以百分比形式表示。

2 结果

2.1 经ETV治疗的相应突变位点 经ETV治疗的患者中，共发生突变类型2种，其中最为常见的当属rtT184A/G/I/S（n=5，构成比=62.50%），其次为RtS202G/I（n=3，构成比=37.50），均为单独突变。

2.2 经ADV治疗的相应突变位点 经ADV治疗的患者中，共发生突变类型3种，其中最为常见的当属rtA181V/T/S（n=8，构成比=12.12%），其次为rtV214A（n=10，构成比=15.15%），然后为rtN236T（n=48，构成比=72.73%）。

2.3 经LAM治疗的相应突变位点 经LAM治疗的患者中，共发生突变类型4种，其中最为常见的当属rtV207I/L/G（n=61，构成比=47.66%）。在联合突变中，rtLI80M+M204V（n=34，构成比=26.56%）的突变率显著高于rtLI80M+M204I（n=21，构成比=16.41%）、rtM204I（n=12，构成比=9.38%）。

2.4 经LdT治疗的相应突变位点 经LdT治疗的患者中，共发生突变类型2种，其中最为常见的当属rt M204I（n=3，构成比=60.00），其次为rtLI80M+M204I（n=2，构成比=40.00%）。

3 讨论

核苷类药物是目前临床治疗慢性HBV感染的常用药，能对病毒起到一定的抑制作用，但用药时间过长易致NA耐药。本研究，在拉米夫定中，M204V/I是主要耐药突变，能使病毒对拉米夫定的敏感性有效降低，其余则表示为代偿变异，在一定程度上能使M204V/I变异病毒的复制能力恢复;N236T为阿德福韦主要耐药突变;T184A/G/I/S为恩替卡韦的主要耐药突变，M204I为替比夫定的主要耐药突变。阿德福韦突变属于二次打击模式，其突变的构建在拉米夫定耐药变异的基础上。拉米夫定和替比夫定均为L-构型的核苷类抗病毒药物，相比拉米夫定其耐药率相对偏低[1]。拉米夫定和替比夫定的耐药位点相似，为逆转录酶 C 区的 rt M204I。所以，LAM耐药者会出现对LdT的高度交叉耐药，在换药时，尽量不实施L-构型核苷类抗病毒药物，建议选用无环核苷酸类药物[2]。

总之，多样化为核苷类四五耐药株的氨基酸突变特点，根据基因型耐药检测结果，待抗病毒失败后对药物给予及时更换。

参考文献

[1] 颜悦蓉，冯继红.替诺福韦酯治疗核苷酸类药物耐药慢性乙型肝炎患者的研究进展.临床肝胆病杂志，2016，32（11）：2182-2185.

[2] 曹辉，张玮. 核苷类药物治疗慢性乙型肝炎患者影响HBeAg血清转换的免疫学因素研究进展.实用肝脏病杂志，2017，20（3）：372-376.