微藻育种的研究进展

单晓慧　王瑶　赵东升

摘要    微藻作为一种单细胞光合自养生物，在海洋中广泛存在。近年来，微藻在食品、药品和生物能源等方面都受到重视。为了得到優良性状的微藻，需要对微藻育种技术进行探究。本文概述了几种微藻育种方法，总结了各方法的优缺点以及研究进展，以期为微藻育种的后续研究提供参考。

关键词    微藻;育种;技术

中图分类号    Q949.2        文献标识码    A

文章编号   1007-5739（2020）16-0142-02

Research  Progress  on  Microalgae  Breeding

SHAN Xiao-hui    WANG Yao    ZHAO Dong-sheng

（School of Life and Environmental Sciences， Wenzhou University， Wenzhou Zhejiang 325035）

Abstract    As a kind of unicellular photosynthetic autotrophic organisms， microalgae exist widely in the ocean. In recent years， microalgae have been valued in food， medicine and bioenergy. In order to obtain microalgae with excellent traits， it is necessary to explore microalgae breeding technology. The advantages and disadvantages of various methods and research progress was summarized， so as to provide a reference for the follow-up research of microalgae breeding.

Key words    microalgae; breeding; technology

微藻是真核生物的最简单形式，具有数量庞大，生长速度快、适应性强的特点，作为初级生产者，能高效率地进行光合作用并释放氧气[1]。同时，微藻在进化上具有多源性以及遗传多样性，能够产生多种次级代谢产物，如不饱和脂肪酸、藻胆蛋白、虾青素等生物活性物质[2-3]。但是，能进行规模养殖的微藻种类不多，微藻的产业化发展存在诸多困难。因此，选择具有优良性状的藻种并将生物技术与传统育种技术结合，是促进微藻开发和利用的重要途径。

1    选择育种

作为基础育种方法，采用自然分离的选择育种法操作简单直接，缺点是费时、遗传性状不稳定等[4]。选择育种的方法包括称重法、平板划线法、稀释法、微吸管法和96孔板法等。

称重法最早是Folch等[5]为了分离和纯化动物组织的总脂而采用的方法。随后，Baldoni等[6]对此方法进行优化，可以快速从组织中提取非极性脂质。Moazami等[7]应用此方法对从波斯湾和克什姆岛采集的147种微藻进行了筛选，得到2株高油脂含量的微藻。谭桂英等[8]利用逐级稀释法从钝顶螺旋藻（Spirulina platensis）中分离得到了6个不同形态的藻株，并从中筛选出一株生长速度快以及蛋白含量高的藻株。张  东等[9]通过96孔板法从天然海水中分离纯化出一株海洋硅藻，并从形态学和分子生物学两方面研究发现其属于微型角毛藻新种[9]。

流式细胞仪分选和微孔板技术是微藻育种的新兴技术，Pereira等[10]将荧光活化细胞分选系统（FACS）与微孔板技术相结合，对环境样品中富含脂质的微藻进行分离，通过FACS直接分选到固体培养基中的扩大培养过程较液体培养大约节约了3周时间。

选择育种法获得的微藻藻株发生变异的几率小，对生物环境以及人类生活不会带来危害，是一种常用的藻种选育方法。

2    诱变育种

天然存在的突变体是由环境效应物，如紫外线辐射或代谢产生的活性氧物质等，与遗传物质之间相互作用产生的，其产生的突变是遗传变异的主要来源，具有进化的潜力[11]。但是，自然诱变过程太慢，无法立即应用于育种或研究[12]。

2.1    物理诱变育种

典型的物理诱变剂包括紫外线、伽马射线或重离子束等。每种类型的辐射对细胞的作用方式和诱变潜力取决于各辐射的能量，而它们的使用频率则取决于是否易于操作[13]。

紫外线诱变育种简单且容易操作，不需要专门的设备以及化学药品，是通过将细胞暴露在无菌环境中的杀菌紫外线灯下进行的。Neupert等[4]利用紫外线对单细胞绿藻莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）进行诱变，从而分离得到高转基因表达的藻株。Jaeger等[15]将斜生栅藻（Scenedesmus obliquus）用紫外线照射后获得3 500多个突变藻株，并从中成功分离出5个无淀粉突变体，均可产生更多的三酰基甘油（triacylglycerol，TAG）。

伽马射线，特别是重离子束辐射需要专用的设备，因而没有得到广泛使用。但Yoon等[16]通过使用不同剂量的伽马射线辐照不同的微藻，突变藻株的油脂含量提高了1.4倍。有人对拟球藻（Nannochloropsis）进行重离子辐照，与野生型相比，突变株的油脂含量增加了28 %，而极性脂质减少了15%，它可以作为微藻生产生物柴油有价值的候选者[16]。

2.2    化学诱变育种

化学诱变是利用一些能导致遗传物质改变的诱变剂，其中使用最广泛的是烷基化试剂，例如甲烷磺酸乙酯（ethyl methane sulfonate，EMS）和甲硝基亚硝胍（1-Methyl-3-nitro-1-nitrosoguanidine，MNNG）。Chaturvedi等[17]用EMS对拟球藻进行诱变后得到抗浅蓝菌素以及抗红霉素的突变藻株，与野生型相比，所含有的二十碳五烯酸（Eicosapentaenoic acid，EPA）分别增加了29%和12%。Lian等[18]用MNNG对裂壶藻（Schizochytrium）进行诱变后获得突变藻株的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性比亲本藻株高，从而能产生更多NADPH，该突变藻株中二十二碳六烯酸（Docosahexaenoic acid，DHA）的含量占总脂肪酸的56.22%，比亲本藻株高17.34%。Ong等[19]用EMS对小球藻（Chlorella）进行诱变后得到2个耐热突变藻株，野生型小球藻生长的最佳温度是25 ℃，而耐热突变藻株在40 ℃的环境中依然能够生长。此外，还有一些天然碱基类似物、亚硝基化合物和叠氮化物等也可作为化学诱变剂[20]。

各种诱变方法的特点不同，在一定剂量以及筛选方法的配合下筛选得到所需的突变藻株，对环境的污染较小，但存在的表型性状不稳定的现象也会对以后的生产产生影响。

3    基因工程

基因工程育种具有针对性强、稳定性强的特点。近年来，微藻的基因工程研究发展迅速，是很多课题组积极研究的方向。随着各种微藻基因组信息的公布，使得微藻的遗传转化体系逐渐完善，比如在三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）[21]、小球藻[22]以及杜氏盐藻（Dunaliella salina）[23]等微藻中进行遗传转化，运用基因敲除和基因沉默的方法实现微藻的基因工程改造，获得所需要的性状。Kilian等[24]将微拟球藻（Nannochloropsis sp.）中编码硝酸盐还原酶和亚硝酸盐还原酶的基因敲除后，其在硝酸盐以及亚硝酸盐的培养基上不能生长。此外，Nymark等[25]和Shin等[26]分别利用CRISPR/Cas9技术对莱茵衣藻和三角褐指藻中的基因进行靶向编辑，从而实现更为准确的基因改造。一些像Algal Functional Annotation Tool，GreenCut2和AlgaGEM等与微藻相关的生物信息学平台的发展[27]，为微藻的相关基因和蛋白质组学的研究提供注释，也为微藻的遗传改造提供了基础。

基因工程育种取得了很大的进展，但在培养的安全性以及外源基因的表达效率等方面依然存在一些问题。随着对微藻遗传特性研究的发展，基因工程育种仍然是一种重要的育种手段。

4    细胞融合

细胞融合是在外力作用下将2个细胞的原生质体融合成为杂交的细胞，从而具有新的遗传学特征，其育种周期短且极易产生变异，但变异并不稳定[28]。1957年，日本微生物研究所首次发现仙台病毒能使相邻的2个细胞融合在一起，此后，细胞融合技术开始应用于育种当中[29]。细胞融合在微藻育种方面也有了发展，Tjahjono等[30]用3种除草剂对雨生红球藻（Haematococcus pluvialis）进行诱变得到3组抗性突变体，将任意2组突变體进行原生质体融合后，融合藻株合成类胡萝卜素的能力较亲本高3倍左右。沈继红等[31]利用细胞化学融合法，将高产EPA和DHA的自养微藻（绿色巴夫藻）与生长迅速的兼养微藻（四鞭藻）进行融合，筛选获得融合藻株，发现其总脂含量以及EPA/DHA等各项指标均有较大提高。

细胞融合育种克服了远缘杂交的困难，拓展了育种的领域，实现了遗传重组，随着原生质体的制备方法和微藻遗传学的研究深入，细胞融合育种技术将会有进一步的发展。

5    参考文献

[1] MAEDA Y，YOSHINO T，MATSUNAGA T，et al.Marine microalgae for production of biofuels and chemicals[J].Current Opinion in Biotechnolo-gy，2018，50：111-120.

[2] MILLEDGE J J.Commercial application of microalgae other than as biofuels：a brief review[J].Reviews in Environmental Science and Bio/Technology，2010，10（1）：31-41.

[3] PULZ O，Gross W.Valuable products from biotechnology of microalgae[J].Applied Microbiology and Biotechnology，2004，65（6）：635-648.

[4] 梁英，陈书秀.微藻育种的研究现状及前景[J].海洋通报，2008，27（3）：88-94.

[5] FOLCH J M，LEE M S-SG，SLOANE-STANLEY G H.A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissue[J].J Biol Chem，1957，226：477-509.

[6] BALDONI E，BOLOGNANI L，VITAIOLI L.A rapid procedure for elimi-nation of non-polar lipids hampering the usual polar lipid extraction and TLC separation[J].European Journal of Histochemistry，1995，39（4）：253-257.

[7] MOAZAMI N，RANJBAR R，ASHORI A，et al.Biomass and lipid produc-tivities of marine microalgae isolated from the Persian Gulf and the Qeshm Island[J].Biomass and Bioenergy，2011，35（5）：1935-1939.

[8] 谭桂英，周百成.钝顶螺旋藻优良品系S_6的生长特性及光合特性的研究[J].海洋学报（中文版），1993（3）：88-93.

[9] 张东，隋正红，王春燕，等.一株海洋微型硅藻的形态学和分子生物学鉴定[J].海洋学报，2010（2）：170-175.

[10] PEREIRA H B L，MOZES A.Microplate-based high throughput screen-ing procedure for the isolation of lipid-rich marine microalgae[J].Biotechnol Biofuels 2011，4（1）：61.

[11] BARTON N H.Mutation and the evolution of recombination[J].Philosop-hical transactions of the Royal Society of London.Series B，Biological Sciences，2010，365（1544）：1281-1294.

[12] EYRE-WALKER A，KEIGHTLEY P D.The distribution of fitness effects of new mutations[J].Nature reviews Genetics，2007，8（8）：610-618.

[13] HLAVOVA M，TUROCZY Z，BISOVA K.Improving microalgae for bio-technology-from genetics to synthetic biology[J].Biotechnology Advanc-es，2015，33（6 Pt 2）：1194-1203.

[14] NEUPERT J，KARCHER D，BOCK R.Generation of Chlamydomonas strains that efficiently express nuclear transgenes[J].Plant J，2009，57（6）：1140-1150.

[15] JAEGER LD，VERBEEK R E M，DRAAISMA R B，et al.Superior triac-ylglycerol（TAG）accumulation in starchless mutants of Scenedesmus obliquus：（I）mutant generation and characterization[J].Biotechnology for Biofuels，2014，7：69.

[16] YOON M，CHOI J I，KIM G H，et al.Proteomic analysis of Spirogyra varians mutant with high starch content and growth rate induced by gamma irradiation[J].Bioprocess and Biosystems Engineering，2013，36（6）：765-774.

[17] CHATURVEDI R F Y.Isolation of enhanced eicosapentaenoic acid pro-ducing mutants of Nannochloropsis oculata ST-6 using ethyl methane sulfonate induced mutagenesis techniques and their characterization at mRNA transcript level[J].Phycological Research，2006，54（3）：208-219.

[18] LIAN M，HUANG H，REN L，et al.Increase of docosahexaenoic acid production by Schizochytrium sp.through mutagenesis and enzyme assay[J].Applied Biochemistry and Biotechnology，2010，162（4）：935-941.

[19] ONG S C，KAO C Y，CHIU S Y，et al.Characterization of the thermal-tolerant mutants of Chlorella sp.with high growth rate and application in outdoor photobioreactor cultivation[J].Bioresource Technology，2010，101（8）：2880-2883.

[20] 張森，刘平怀，杨勋，等.富油微藻育种技术研究进展[J].广东农业科学，2013，40（14）：232-236.

[21] BOWLER C，ALLEN A E，BADGER J H，et al.The Phaeodactylum gen-ome reveals the evolutionary history of diatom genomes[J].Nature，2008，456（7219）：239-244.

[22] EL-SHEEKH M M.Stable transformation of the intact cells of Chlorella kessleri with high velocity microprojectiles[J].Biologia Plantarum，1999， 42（2）：209-216.

[23] FENG S，XUE L，LIU H，et al.Improvement of efficiency of genetic transformation for Dunaliella salina by glass beads method[J].Molecular Biology Reports，2009，36（6）：1433-1439.

[24] KILIAN O，BENEMANN C S，NIYOGI K K，et al.High-efficiency hom-ologous recombination in the oil-producing alga Nannochloropsis sp[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2011，108（52）：21265-21269.

[25] NYMARK M，SHARMA A K，SPARSTAD T，et al.A CRISPR/Cas9 system adapted for gene editing in marine algae[J].Scientific Reports，2016，6：24951.

[26] SHIN S E，LIM J M，KOH H G，et al.CRISPR/Cas9-induced knockout and knock-in mutations in Chlamydomonas reinhardtii[J].Scientific Reports，2016，6：27810.

[27] LOPEZ D C D，COKUS S J.Algal functional annotation tool：a web-based analysis suite to functionally interpret large gene lists using integrated annotation and expression data[J].BMC Bioinformatics，2011，12（282）：282.

[28] GEORGIANNA D R，MAYFIELD S P.Exploiting diversity and synthetic biology for the production of algal biofuels[J].Nature，2012，488（7411）：329-335.

[29] 陳梅，唐运来.高油脂产量微藻的选育方法及研究进展[J].安徽农业科学，2012，40（24）：12196-12198.

[30] TJAHJONO A E，KAKIZONO T，HAYAMA Y，et al.Isolation of resistant mutants against carotenoid bioeynthezis inhibitors for a green alga Hae-matococcus pluvislis and their hybrid formation by protoplast fusion for breeding of higher astaxanthin producers[J].J Ferment Bioengng，1994， 77：352-357.

[31] 沈继红，林学政，刘发义，等.细胞融合法构建EPA和DHA高产异养藻株的研究[J].中国水产科学，2001（2）：64-67.

作者简介   单晓慧（1992-），女，山东青岛人，在读硕士研究生。研究方向：藻类次生代谢与调控。

收稿日期   2020-04-20