蒙古柳逆境应答研究进展

张云鹏　许昕薷　戴绍军　李莹1

摘要    蒙古柳是杨柳科柳属的灌木或小乔木，具有耐旱和盐碱特性，是固沙造林、改良贫瘠土壤的优势树种之一，具有较高的生态效益、经济效益和社会效益。本文综述了蒙古柳的形态特征、盐碱应答特性以及遗传转化体系等方面的研究进展，以期为深入研究蒙古柳逆境应答分子机理提供参考。

关键词    蒙古柳;形态特征;逆境应答;基因

中图分类号    S792.12        文献标识码    A

文章编号   1007-5739（2020）16-0102-02

Research  Progress  on  Adversity  Response  of  Salix  linearistipularis

ZHANG Yun-peng 1    XU Xin-ru 1    DAI Shao-jun 2 *    LI Ying 1

（1 Key Laboratory of Saline-alkali Vegetation Ecology Restoration ，Ministry of Education，College of Life Sciences，Northeast Forestry University，Harbin Heilongjiang 150040; 2 Development Center of Plant Germplasm Resources，College of Life Sceences，Shanghai Normal University）

Abstract    Salix linearistipularis belongs to Salix in Salicaceae， is shrub or dungarunga species with strong tolerance for drought and salineal-kaline. It is one of dominant tree species for sand-fixation， afforestation and barren soil improvement， which has high ecological， economic and social benefits. In this paper， the morphological characteristics， salinealkaline response and genetic transformation system of Salix linearistipularis were revie-wed. This will provide valuable information for better understanding of the molecular mechanisms of adversity response in Salix linearistipularis.

Key words    Salix linearistipularis; morphological characteristic; adversity response; gene

蒙古柳（Salix linearistipularis），又稱筐柳，是杨柳科柳属多年生木本植物，为灌木或小乔木。蒙古柳主产于我国陕北榆林地区，主要分布于东北、西北和中部地区，在蒙古和俄罗斯远东地区也有分布[1]，常分布于海拔100～1 800 m的平原、低湿地、河湖岸边及盐碱化草甸。蒙古柳具有较强的抗逆能力，是苏打盐碱地内唯一具有群落分布的木本植物，也是我国松嫩平原盐碱地区域内珍贵的盐生木本植物资源。蒙古柳是菌根形成的宿主植物，其根系形成的菌根能使根部周围土壤的pH值降低，能有效改善盐碱地土壤环境[2]。但是，蒙古柳的人工引种栽培技术目前尚不成熟[3]，其耐盐碱的分子生理学研究也十分匮乏。本文对蒙古柳形态特征、盐碱应答特性以及遗传转化体系建立进行了综述，以期为蒙古柳的推广种植提供参考。

1    蒙古柳形态特征

蒙古柳株高2～8 m，为灌木或小乔木。树皮为黄灰色至暗灰色，枝条暗绿至暗黄色，细长且无毛，柔软丛生。叶片长8～15 cm、宽0.6～1.2 cm，托叶与叶片均为线形或披针形线状。幼叶呈嫩绿色，叶片表面有绒毛，边缘有腺齿;成熟后叶片呈深绿色，叶表面绒毛脱落，叶片背面呈灰白色。成熟的蒙古柳种子呈白绿色、深绿色或暗绿色，为类长圆柱形。种子顶端有凸起，由种脐、种脊和种阜组成。种子具有白色冠毛，无翅、刺、芒等附属物，白色冠毛长度为种子长度的3～6倍。蒙古柳种子由种皮和胚构成，种皮较薄，由透明的角质层构成，侧表面呈皱裙状;胚具有2片子叶，由薄壁细胞构成，胚细胞大小、形状几乎一致，呈类圆形。蒙古柳植株结实率较高，种子无休眠现象。但蒙古柳种子萌发对土壤水分需求极为严格，只有在土壤含水量为100%～200%的条件下才能萌发，常生长在河边、平原低湿地或湖岸边，并且低温保存有利于延长种子活性[4]。

蒙古柳是一种典型的雌雄异株植物，雌雄株存在明显差异[5]。雄株的鲜重、干重、叶长宽、叶面积、上表皮角质层厚度及气孔密度均大于雌株，而雄株叶片下表皮角质层厚度和气孔密度却小于雌株。生理指标测定发现，雌株体内游离脯氨酸、丙二醛、叶绿素含量均高于雄株，而相对电导率和可溶性糖含量低于雄株。利用扫描电镜观察蒙古柳成熟期叶片的显微结构发现，雄株第1层栅栏组织厚度明显小于雌株。此外，蒙古柳雌雄株花芽也存在显著差别。在花芽分化初期，雄花花芽呈类三角形，雌花花芽呈类椭圆形，且雄花花芽大于雌花花芽;在花芽发育期，雄花花芽膨大伸长速率小于雌花花芽;成熟期，雄花花芽体积小于雌花花芽。雌花花芽顶部呈尖锐状，花芽尖微翘与枝条呈一定角度;雄花花芽顶部平滑紧附于枝条。雌花雌蕊子房分化时间要长于雄花雄蕊分化时间，通常雌花雌蕊子房分化时间比雄花花药分化时期提前1周左右。雌蕊蜜腺发达，在分化期持续发育，而雄蕊中未见明显蜜腺。在花序期，雌雄花均为柔荑花序，雄花序比雌花序短，同时雄花寿命也短于雌花。雄花散粉后萎蔫脱落，雌花将继续生长发育[5]。因此，在春季通过观察花芽与小枝夹角、花芽萎蔫脱落程度、叶表皮毛的基本形态可初步确定蒙古柳的性别。

2    蒙古柳逆境应答研究

蒙古柳根系发达，生长迅速，萌芽力强，耐寒耐热，对盐碱、干旱等非生物胁迫有较强的适应力。钱路[4]分析蒙古柳种子抵御盐、碱、干旱胁迫能力发现，用5% PEG6000处理的蒙古柳种子萌发率略高于未经处理的种子，而20% PEG6000处理的种子萌发被抑制，萌发率明显低于未经处理的种子。可见，低浓度PEG6000可促進蒙古柳种子萌发。在盐碱胁迫下，蒙古柳种子的萌发率、发芽势、萌发指数、种子活力均一定程度受到盐碱抑制，低浓度的NaHCO3（10～30 mmol/L）却促进蒙古柳胚根的伸长[4]。在50 mmol/L NaCl和10 mmol/L NaHCO3胁迫处理下，已培养30 d的蒙古柳幼苗生长状态优于未经处理的蒙古柳幼苗;100 mmol/L NaCl和40 mmol/L NaHCO3处理的蒙古柳幼苗能继续生长，但叶片出现盐害症状。对叶片和根的显微结构观察发现，盐碱处理后气孔关闭，同时气孔下陷数量明显增加，这可能有利于减少体内水分散失;盐碱处理后根部结构改变，根的表皮和外皮层消失，皮层薄壁组织出现不规则分布，通气组织消失，维管束初生木质部导管数量减少，但导管直径增大，这可能有利于水分运输，支持蒙古柳幼苗在盐碱胁迫下继续生长[4]。蒙古柳雌、雄株对盐的耐受性存在差异，雌株的耐盐碱能力更强[6]。

在盐胁迫条件下，缺氮和氮过量都抑制蒙古柳种子萌发和根的生长。氮素过量对蒙古柳种子萌发和根生长抑制更明显，植株氮素代谢（尤其是尿素代谢）的产物尿素和NH4+含量明显高于缺氮植株。盐胁迫下，更换不同形式氮源（尿素、精氨酸、硝酸钾、氯化铵和硝酸铵）对植株的影响不同[7]。以硝酸钾作唯一氮源时，蒙古柳种子萌发率未受影响，其体内尿素和NH4+含量没有明显变化;而分别以尿素、精氨酸、氯化铵和硝酸铵作唯一氮源时，随着氮浓度升高，蒙古柳种子萌发率明显降低，体内氮素代谢产物显著升高。这可能是尿素、精氨酸、氯化铵和硝酸铵在氮素代谢过程中均能产生尿素并促进尿素代谢造成的。外源加入精氨酸酶抑制、脲酶抑制剂都能阻断精氨酸分解产生尿素和尿素代谢，种子萌发率受抑制程度得到缓解，种子内尿素和NH4+含量也显著性下降。可见，阻断尿素生成与代谢可以缓解盐胁迫对蒙古柳种子萌发造成的影响[7]。

3    蒙古柳盐应答基因功能分析

利用RNA-sequence技术对未处理和100 mmol/L NaCl处理的蒙古柳叶片进行分析，鉴定出3 034个差异基因，其中上调表达基因1 397个，下调表达基因1 637个。GO富集分析显示，这些基因富集于50个亚类中，主要包括次生代谢产物的生物合成、植物病原菌互作、植物激素信号转导等代谢通路中[8]。利用RNA-sequence技术对蒙古柳萌动期雌花花芽、雄花花芽以及雌雄株叶芽进行分析，以雄株叶芽为对照，共有153个雄花花芽特异表达基因，这些基因主要参与果实成熟、花序形态形成、负调控长日照光周期、开花、叶片衰老5个代谢通路中;以雌株叶芽为对照，共有292个雌花花芽特异表达基因，主要参与生长素合成、胚乳发育、分生组织形成等[9]。

汪振娟[10]克隆得到定位于细胞核中的SaWRKY28基因。在80 mmol/L NaCl、6 mmol/L NaHCO3胁迫下，转SaWRKY28基因拟南芥植株比野生型植株具有更强的耐盐碱能力。由此可见，SaWRKY28转录调控因子在蒙古柳抵御盐碱胁迫过程中发挥了重要作用。

南桂仙等[8]将转基因拟南芥和野生型拟南芥在不同的逆境下进行抗性分析，结果发现，蒙古柳金属硫蛋白基因在1.3 mol/L和1.5 mol/L NaCl、3 mmol/L和3.5 mmol/L NaHCO3、70 μmol/L和 80 μmol/L CuCl2、100 μmol/L和150 μmol/L CdCl2、0.8 mol/L和1 mol/L ZnCl2胁迫处理下，转SaMT基因拟南芥种子的萌发率高于野生型;在150 mmol/L和170 mmol/L NaCl、3 mmol/L NaHCO3、3 mmol/L H2O2、100 μmol/L和150 μmol/L CdCl2、300 mmol/L和350 mmol/L Sorbital处理下，转SaMT基因拟南芥根长度高于野生型。由此表明，蒙古柳金属硫蛋白基因的过表达能显著增强拟南芥植株对NaCl、NaHCO3、H2O2、CuCl2、ZnCl2、CdCl2的抗性。

4    蒙古柳遗传转化体系的建立

GUAN Q J等[11]初步建立了蒙古柳遗传转化体系，以蒙古柳叶片作为外植体，利用含有1.5 mg/L 2，4-二氯苯氧基乙酸（2，4-D）、0.5 mg/L 6-苄氨基腺嘌呤（6-BA）、30 g/L 萘乙酸（NAA）的MS培养基可获得蒙古柳愈伤组织，经过不定芽分化和不定根诱导，获得蒙古柳再生植株。利用农杆菌转染的方式将pCXSN-gus质粒转入幼嫩蒙古柳愈伤组织，可获得转基因植株。这为蒙古柳耐逆分子机理研究奠定了基础。

5    展望

蒙古柳是我国北部重要的耐盐碱树种，易繁殖，生长快，萌芽力强。目前，对蒙古柳形态结构、繁殖方式、遗传转化以及逆境应答基因功能的研究十分有限[12-13]。在此基础上，开展蒙古柳植物资源调查、耐逆品种选育，并利用整合组学与分子遗传学技术深入揭示蒙古柳逆境应答分子机理是将来急需开展的工作[14-15]。

6    参考文献

[1] 柳参奎.中国东北盐碱地植物原色图鉴[M].哈尔滨：东北林业大学出版社，2006.

[2] ISHIDA T A，NARA K，MA S R，et al. Ectomycorrhizal fungal community in alkaline-saline soil in northeastern China[J].Mycorrhiza，2009，19（5）：329-335.

[3] 罗伟祥，刘广全，李嘉珏，等.西北主要树种培育技术[M].北京：中国农业出版社，2007.

[4] 钱璐.环境因子对蒙古柳（Salix linearistipularis）种子萌发的影响[D].哈尔滨：东北林业大学，2015.

[5] 张美娇.蒙古柳（Salix linearistipularis）雌雄株差异性分析[D].哈尔滨：东北林业大学，2016.

[6] 齐琪.蒙古柳雌雄株扦插苗对盐碱胁迫的响应[D].哈尔滨：东北林业大学，2019.

[7] 魏芝玲.尿素代谢对蒙古柳耐盐性的影响研究[D].哈尔滨：东北林业大学，2019.

[8] 南桂仙，乔坤，高野哲夫，等.蒙古柳金属硫蛋白的拟南芥遗传转化及抗性分析[J].基因组学与应用生物学，2015，34（1）：28-34.

[9] 孙亚军.基于RNA-Seq的蒙古柳（Salix linearistipularis）雌雄花芽萌动期特异表达基因解析[D].哈尔滨：东北林业大学，2017.

[10] 汪振娟.SmWRKY28蛋白參与蒙古柳抗NaCl、NaHCO3胁迫的调节功能研究[D].哈尔滨：东北林业大学，2016.

[11] GUAN Q J，HE M，MA H，et al.Construction of genetic transformation system of Salix mongolica：in vitro leaf-based callus induction，adventi-tious buds differentiation，and plant regeneration[J].Plant Cell，Tissue and Organ Culture，2017，132（1）：1-5.

[12] 马书荣，李韫，石美玉，等.盐碱胁迫对蒙古柳无性系生理特性的影响[J/OL].分子植物育种：1-13[2020-07-31].http：//kns.cnki.net/kcms/detail/46.1068.s.20200226.2148.012.html.

[13] 南桂仙.蒙古柳（Salix linearistipularis）耐盐相关基因的挖掘研究[D].哈尔滨：东北林业大学，2014.

[14] 韩雪.山新杨高效遗传转化体系的建立及蒙古柳FOX山新杨抗性植株的获得[D].哈尔滨：东北林业大学，2013.

[15] 郭瑶，吴建慧.蒙古柳的组织培养与快速繁殖[J].植物生理学通讯，2009，45（12）：1211-1212.

基金项目   中央高校基本科研业务专项资金资助项目（2572018BS03;2572017ET01）。

作者简介   张云鹏（1995-），男，黑龙江绥化人，在读硕士研究生。研究方向：蒙古柳蛋白质组学研究。

通信作者

收稿日期   2020-04-05