ICP患者血清疏水性胆汁酸与miR-18a水平的相关性研究

利荣乔，陈 晖，蓝欲裕，姚人业

1.广西壮族自治区江滨医院检验科，广西南宁 530000；2.广西壮族自治区妇幼保健院检验科，广西南宁 530000

妊娠期肝内胆汁淤积症(ICP)是妊娠期一种重要的并发症，其可致孕妇皮肤瘙痒、黄疸、早产、死胎、死产，致胎儿宫内窘迫、中枢神经系统缺氧损伤，该疾病导致围生儿发病率和病死率增加。研究表明，疏水性胆汁酸在ICP发生、发展中发挥重要作用[1-2]。此外，雌激素受体α(ERα)在转录和翻译水平均受miR-18a的负性调控[3]，提示miR-18a可能通过调控ERα的表达，进而调控胆汁酸，特别是疏水性胆汁酸的体内淤积，在ICP的发生、发展中发挥重要作用。本研究旨在探讨ICP患者血清miR-18a水平与血清硫水性胆汁酸的相关性。现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 根据随机数字表法随机选取2017年12月至2019年3月广西壮族自治区江滨医院确诊的120例轻度、中度、重度ICP患者各40例及同期健康孕妇40例，孕妇年龄为22～34岁，平均(28±4)岁；孕周为28～37周，平均(32.0±4.3)周。4组孕妇一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。纳入标准：临床资料完整；单胎妊娠；妊娠前检查未见瘙痒，妊娠期出现瘙痒，且瘙痒只与妊娠有关。排除标准：肝炎患者、严重妊娠期合并症或并发症者及其他不适合参加本次研究者。

1.2ICP患者分度诊断标准 轻度ICP：总胆汁酸(TBA)≥10～<40 μmol/L，总胆红素(TBIL)<20 μmol/L；中度ICP：TBA≥40～<80 μmol/L，TBIL≥20～<40 μmol/L；重度ICP：TBA≥80 μmol/L，TBIL≥40 μmol/L[4-5]。

1.3仪器与试剂 RNAiso Blood(货号：9112)，逆转录试剂盒(货号：RR037)及TB Green Premix Taq(货号：RR820)扩增试剂均购自Takara公司，has-miR18a及U6逆转录和扩增引物由上海生工合成。荧光定量PCR仪为Agilent AriaMx。 has-miR18a引物：上游：5′-GGG GTG TTC TAA GGT GCA TCT A-3′；下游：5′-CAG TGC GTG TCG TGG AGT-3′；U6引物：上游：5′-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3′；下游：5′-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3′。

1.4方法 孕妇入院接受腹部超声检查，明确孕期；清晨安静空腹状态下抽取外周血标本5 mL，妥善保存后送检实验室进行处理及检测。标品标准化前处理后采用高效液相色谱串联质谱法检测脱氧胆酸(DCA)、鹅脱氧胆酸(CDCA)，甘氨鹅脱氧胆酸(GCDCA)和石胆酸(LCA)水平，色谱条件：pH 1～12柱100 μm×23 μm，预柱为Luna C18(2) 3 μm (10 mm×2 mm)柱，流速：0.20 mL/min，柱温：35 ℃，流动相:甲酸氨水溶液体积比为1∶200，乙酸水溶液(用氨水调节pH=4.5)∶甲醇为30∶70；质谱条件：ESI选择性正离子检测，SIM方式检测。工作参数：干燥氮气温度200 ℃，雾化器流量1.5 L/min，检测电压1.40 kV。

2 结 果

2.1各组孕妇血清中miR-18a水平比较 与健康对照组比较，轻度、中度和重度ICP组血清中miR-18a水平明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与轻度ICP组比较，中度和重度ICP组血清中miR-18a水平明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与中度ICP组比较，重度ICP组血清中miR-18a水平明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 各组孕妇血清中miR-18a水平

2.2各组孕妇血清中DCA、CDCA、GCDCA、LCA水平比较 与健康对照组比较，轻度、中度和重度ICP组血清中DCA、CDCA、GCDCA、LCA水平均升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与轻度ICP组比较，中度和重度ICP组血清中DCA、CDCA、GCDCA、LCA水平均升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与中度ICP组比较，重度ICP组血清中DCA、CDCA、GCDCA、LCA水平均升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 各组孕妇血清中DCA、CDCA、GCDCA、LCA水平

2.3各组孕妇血清miR-18a与DCA、CDCA、GCDCA、LCA水平的相关性分析 健康对照组孕妇血清miR-18a水平与DCA、CDCA、GCDCA、LCA水平均不相关(P>0.05)；轻度、中度及重度ICP组孕妇血清miR-18a水平与DCA、CDCA、GCDCA、LCA水平均呈负相关(r=-0.847～-0.531,P<0.05)。见表3。

表3 各组孕妇血清miR-18a与DCA、CDCA、GCDCA、LCA水平的相关性分析

3 讨 论

ICP多发生于妊娠中晚期，属可逆性胆汁淤积症，ICP 的病因是多因素的，遗传易感性、激素和环境因素在其发病机制中相互作用。其临床特点是妊娠30周后开始出现轻微或者严重瘙痒症状，通常在分娩后 48 h 症状缓解。除了难治性瘙痒和产后出血，孕产妇的预后通常是良好的。但ICP与胎儿发病率和病死率密切有关，特别是早产、胎儿窘迫和突然的不可预测的胎儿宫内死亡。

ICP 与TBA水平升高有关。本研究表明，疏水性胆汁酸与ICP的发生、发展密切相关。胆汁酸分子内既含有亲水性的羟基及羧基，又含有疏水性烃核和甲基。亲水基团均为α型，而甲基为β型，两类不同性质的基团位于环戊烷多氢菲核的两侧，这种构型使得胆汁酸有疏水性和亲水性两种性质。疏水性胆汁酸包括胆酸(CA)、DCA、CDCA、GCDCA和LCA，其疏水性的大小顺序依次为LCA>GCDCA>DCA>CDCA>CA。疏水性胆汁酸能破坏细胞基底外膜、细胞器膜并特异性破坏微管膜的外层，对机体危害较大[6-7]。疏水性胆汁酸损伤细胞的机制与以下机制有关：(1)作为炎症刺激剂活化细胞内信号转导途径，直接刺激促炎介质的产生；(2)引起线粒体机能障碍，导致过量活性氧的产生和内膜通透性的改变；(3)通过内质网应激介导细胞损伤[8-10]。

ICP多发生于妊娠晚期、多胎妊娠、既往有口服高雌激素水平避孕药的女性，此类人群雌激素均处于高水平状态，提示ICP发生与雌激素有关[11]。ICP在多胎孕妇中的患病率是单胎孕妇的5倍，这与更高水平的雌激素是相关的。ICP与其他类型胆汁淤积相似，在使用过含雌激素剂量大的避孕药的女性中发生率较高。有研究证明，雌激素能够抑制血糖利用，促进脂肪分解，释放游离脂肪酸，而高水平游离脂肪酸诱发肝脏损伤，进而加重胆汁淤积。当机体内部雌激素代谢产物增加时可导致胆汁排泄受阻，从而影响肝脏对硫酸盐的代谢及排泄，表明高水平的雌激素可能通过受损硫酸盐化作用和胆汁酸运输诱导肝内胆汁淤积。ERα在人体内广泛分布，与其他亚型受体互补共存，共同介导雌激素在靶器官中发挥效应。而在胚胎着床、胎盘发育等妊娠生理过程中，ERα更是起到重要生理介导作用。研究表明，ERα的异常表达可能与病理妊娠相关[12-13]。miRNA是一类非编码小分子RNA，通过与靶mRNA的3′非编码区结合后调控相关基因转录翻译，进而影响细胞生理过程，既往研究表明，ERα在转录和翻译水平均受miR-18a的负性调控[3]。

本研究发现，各ICP组血清疏水性LCA、GCDCA、DCA和CDCA水平明显高于健康对照组，且随病情加重，LCA、GCDCA、DCA和CDCA水平越高；各ICP组血清miR-18a明显下调，且随病情加重，miR-18a水平越低。ICP组血清miR-18a水平与疏水性胆汁酸水平呈负相关(r=-0.847～-0.531;P<0.05)。因miR-18a可负性调控ERα，笔者推测，血清miR-18a水平下调的孕妇，其组织ERα水平上调，致其对雌激素的敏感性升高，进而导致疏水性胆汁酸在体内积聚，对胎儿造成危害，同时亦损伤孕妇肝细胞，形成恶性循环。ICP的诊断需要排除其他胆汁淤积和肝脏疾病，miR-18a有望成为ICP诊断的新血清学标志物，也有望成为鉴别诊断ICP 的新依据，值得进一步深入研究。