C肽对2型糖尿病性骨质疏松大鼠骨组织代谢及成骨能力的影响Δ

肖 婷，邓向群

(武汉市第三医院内分泌科，湖北 武汉 430000)

骨质疏松症是由于骨微结构损坏导致骨脆性增加，骨吸收与骨形成的平衡逐渐打破，骨量低下，最终引起骨折的一种全身性疾病[1]。研究结果表明，绝经后女性及2型糖尿病皆是患骨质疏松症以及骨质疏松性骨折的危险因素[2]。糖尿病性骨质疏松是糖尿病常见的并发症之一，约50%～60%的糖尿病患者有不同程度的骨量减少[3]，其中30%的糖尿病患者确诊为糖尿病性骨质疏松[4]。C肽是胰岛素原转变为胰岛素时切下的一段肽链，与胰岛素等分子释放入血[5]。同时，C肽的含量检测是衡量胰岛功能的一项标准，可通过该指标有效掌握患者胰岛β细胞的合成及释放等情况[6]。如果检测出患者血清C肽水平偏低，则说明患者体内胰岛素β细胞出现了功能退减的情况[7]。近年来，C肽在糖尿病中的生理功能和潜在的保护作用备受关注，目前研究结果表明C肽主要与糖尿病肾病、糖尿病神经病变、糖尿病视网膜病变及糖尿病导致的大血管病变有关，呈现潜在的组织保护作用[8]。C肽不足被认为是除胰岛素缺乏、高血糖之外导致糖尿病并发症发生发展的主要因素之一[9]。本研究准备建立在体2型糖尿病性骨质疏松(type 2 diabetic osteoporosis，T2DOP)大鼠模型，通过皮下注射C肽后检测大鼠骨代谢及成骨能力，研究C肽对2型糖尿病引起的骨质疏松的防治作用，研究成果将为2型糖尿病引发并发症的预防提供线索，为T2DOP的临床防治提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器、药品与试剂：Ca (钙)、P (磷)测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所；Ⅰ型前胶原氨基端肽 (procollagen Ⅰ N-terminal propeptide，PⅠNP)、骨钙素 (osteocalcin，OCN)、Ⅰ型胶原羧基端肽 (collagen Ⅰ carboxyl terminal peptide，CTX-Ⅰ)、尿脱氧吡啶啉(deoxypyridine, DPD) 检测试剂盒均购自Cusabio BIO-Technology有限公司；碱性磷酸酶 (alkaline phosphatase，ALP) 检测试剂盒购自碧云天生物技术有限公司；C肽及链脲佐菌素 (STZ) 购自Sigma公司，纯度99%；血糖仪购自罗氏公司 (CR2032)。

1.1.2 动物：3月龄雌性大鼠，体重220～245 g，购自湖北省疾病预防控制中心。

1.2 方法

1.2.1 实验动物分组及处理：大鼠饲养于华中科技大学同济医学院实验动物中心SPF级动物房。大鼠接受自由饮食饮水，控制日夜周期。将60只大鼠随机分为假手术组(Sham组，15只)、T2DOP组(15只)及C肽组(8、12周，分别15只)。按文献中的方法建立T2DOP大鼠模型[10]。检测大鼠血糖水平，血糖>16.7 mmol/L时确定糖尿病模型建立成功[11]；选取去卵巢手术成功且成功建立糖尿病模型的大鼠建立T2DOP大鼠模型。Sham组大鼠麻醉后不切除卵巢，C肽组大鼠采用C肽(130 nmol/Kg)皮下注射，1日2次，C肽 (8周)组大鼠共接受C肽治疗8周，C肽 (12周)组大鼠共接受C肽治疗12周。

1.2.2 大鼠血液中相关指标检测：(1)血糖检测。实验结束后，所有大鼠取尾静脉血，利用血糖仪进行血糖的测定，血糖≥16.7 mmol/L为糖尿病造模成功。(2)血清中矿物质Ca、P、ALP、PⅠNP、CTX-Ⅰ及OCN水平测定。取各组大鼠腹主动脉血，以3 000 r/min 离心15 min，取血清，按照试剂盒说明书中方法测定血清中矿物质Ca、P及ALP、P Ⅰ NP、CTX-Ⅰ 及OCN水平。

1.2.3 大鼠尿液中矿物质Ca、P及DPD含量测定：取各组大鼠尿液，按照试剂盒说明书中方法对尿液中Ca、P及DPD含量进行测定。

1.2.4 大鼠股骨骨密度 (BMD)和股骨组织微结构的检测：(1)取股骨大鼠，采用小动物双能X线骨密度仪对大鼠股骨进行扫描，选定股骨远端为主要检测区域进行图像分析，得到大鼠股骨的BMD[12]。(2)取大鼠股骨，采用VivaCT40(Scancomedical，瑞士)扫描各组大鼠股骨，选定股骨头下0.5 cm为检测区域进行图像分析，得到骨表面积与体积分数比(BS/BV)、骨小梁体积分数比(BV/TV)、骨小梁分离度(Tb.Sp)、骨小梁数量(Tb.N)、结构模型指数(structure model index，SMI) 和连接密度(Conn.D)参数值。

1.2.5 大鼠股骨生物力学检测：取大鼠股骨，按照文献方法检测股骨生物学特性，首先设定下降速度加载负荷，为1 mm/min，根据载荷-位移曲线计算最大载荷和弹性模量[13]。

2 结果

2.1 C肽对T2DOP大鼠血糖水平的影响

T2DOP组大鼠血糖水平较Sham组明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)，且血糖≥16.7 mmol/L，证明糖尿病模型建立成功；与T2DOP组比较，C肽组大鼠血糖水平显著降低，以12周治疗组更为明显，差异有统计学意义(P<0.01)，证明C肽对T2DOP大鼠的血糖具有调节作用，见图1。

与Sham组相比，*P<0.05，**P<0.01；与T2DOP组相比， #P<0.05，##P<0.01 vs. Sham group, *P<0.05, **P<0.01; vs. T2DOP group, #P<0.05, ##P<0.01图1 C肽对T2DOP大鼠血糖水平的影响Fig 1 Effects of C-peptide on blood glucose levels of T2DOP rats

2.2 C肽对T2DOP大鼠骨矿物质代谢及骨组织形成的影响

实验结束后,对各组大鼠血清及尿液中的Ca、P水平进行检测，间接反映出各组大鼠的骨代谢情况[14]。根据结果，与Sham组比较，T2DOP组大鼠血清中Ca、P含量明显降低，尿液中的Ca、P含量明显升高，差异均有统计学意义(P<0.01)，证明T2DOP大鼠骨矿物质代谢增加，T2DOP模型建立成功；与T2DOP组相比，C肽(12周)组大鼠血清中Ca、P含量明显升高，尿液中的Ca、P含量明显降低，差异均有统计学意义(P<0.01)，证明经过C肽不同周期的治疗后，T2DOP大鼠骨矿物质代谢呈时间依赖性显著降低，见图2。

与Sham组相比，*P<0.05，**P<0.01；与T2DOP组相比， #P<0.05，##P<0.01 vs. Sham group, *P<0.05, **P<0.01; vs. T2DOP group, #P<0.05, ##P<0.01图2 C肽对T2DOP大鼠血清和尿液中钙和磷含量的影响Fig 2 Effects of C-peptide on the contents of calcium and phosphorus in serum and urine of T2DOP rats

实验结束后,对各组大鼠血清中PⅠNP、ALP及OCN含量进行检测，反应各组大鼠骨形成情况；对血清中CTX-Ⅰ和尿液DPD进行检测，反映大鼠骨吸收情况[15]。根据实验结果，与Sham组比较，T2DOP组大鼠血清中ALP、OCN及CTX-Ⅰ水平和尿液中DPD水平明显升高(P<0.01)，PⅠNP水平明显降低(P<0.01)；与T2DOP组相比，C肽(12周)组大鼠血清OCN水平有所降低(P<0.05)，血清ALP、CTX-Ⅰ水平及尿液中DPD水平显著降低(P<0.01)，血清PⅠNP含量显著升高(P<0.01)，上述差异均有统计学意义，提示C肽能够抑制T2DOP造成的骨吸收并促进骨组织形成，增强成骨能力，见图3—4。

2.3 C肽对T2DOP大鼠股骨BMD、强度及其骨组织微结构的影响

实验结束后，利用实验机器对各组大鼠的股骨BMD及骨组织微结构进行检测，以反应骨质疏松造成的骨量降低及骨组织微结构破坏是否能通过C肽的治疗有所改善。根据检测结果，与Sham组相比，T2DOP组大鼠股骨BMD显著降低(P<0.01)；与T2DOP组相比，C肽(8周)组大鼠股骨BMD有所升高(P<0.05)，C肽(12周)组大鼠股骨BMD显著升高(P<0.01)，上述差异均有统计学意义，证明C肽对T2DOP造成的BMD降低有缓解甚至逆转的作用，见图5。

与Sham组相比，*P<0.05，**P<0.01；与T2DOP组相比， #P<0.05，##P<0.01 vs. Sham group, *P<0.05, **P<0.01; vs. T2DOP group, #P<0.05, ##P<0.01图3 C肽对T2DOP大鼠血清ALP、PⅠNP和OCN 含量的影响Fig 3 Effects of C-peptide on the contents of ALP, PⅠNP and OCN in serum of T2DOP rats

与Sham组相比，*P<0.05，**P<0.01；与T2DOP组相比， #P<0.05，##P<0.01 vs. Sham group, *P<0.05, **P<0.01; vs. T2DOP group, #P<0.05, ##P<0.01图4 C肽对T2DOP大鼠血清CTX-Ⅰ和尿液DPD 含量的影响Fig 4 Effects of C-peptide on the contents of CTX-Ⅰ in serum and DPD in urine of T2DOP rats

通过对各组大鼠的骨组织微结构进行检测后发现，与Sham组相比，其他各组大鼠BV/TV、BS/BV、Tb.N、Conn.D显著降低，Tb.Sp、SMI显著增加，差异均有统计学意义(P<0.01)；与T2DOP组相比，C肽组大鼠BV/TV、BS/BV、Tb.N、Conn.D呈升高趋势，而Tb.Sp、SMI明显降低，C肽对T2DOP造成的骨组织微结构破坏具有保护作用，且呈剂量依赖性好转，见表1。

实验结束后,利用微机控制电子万能试验机对各组大鼠的股骨最大载荷及弹性模量进行检测，以反映各组大鼠的股骨强度[16]。根据检测结果，T2DOP组大鼠股骨最大载荷及弹性模量与Sham组相比显著降低(P<0.01)，C肽(12周)组大鼠最大载荷及弹性模量较T2DOP组明显升高(P<0.05)，差异均有统计学意义，提示C肽能够增强T2DOP大鼠骨强度，见图6。

表1 C肽对T2DOP大鼠骨微结构变化的影响Tab 1 Effects of C-peptide on bone microstructure of T2DOP rats

与Sham组相比，*P<0.05，**P<0.01；与T2DOP组相比， #P<0.05，##P<0.01 vs. Sham group, *P<0.05, **P<0.01; vs. T2DOP group, #P<0.05, ##P<0.01图5 C肽对T2DOP大鼠股骨BMD的影响Fig 5 Effects of C-peptide on BMD of femur of T2DOP rats

3 讨论

随着人们饮食及生活习惯的改变，糖尿病的发病率明显升高。骨质疏松作为糖尿病常见的慢性并发症，发病率随之升高。骨质疏松表现为骨密度降低，骨微结构被破坏，骨韧性降低等。糖尿病合并骨质疏松患者不仅受胰岛素缺乏、敏感性降低等影响导致代谢紊乱，同时其骨组织代谢、骨形成受到了严重影响[17]。C肽是胰岛素原转变为胰岛素时裂解的产生的含有31个氨基酸的多肽链。以往研究结果认为，C肽除辅助胰岛素的作用之外并无其他的生物活性。而近年来有研究结果表明，C肽具有改善糖尿病微循环的作用[18]；胰岛素联合C肽对于1型糖尿病的视神经病变具有明显的改善作用，且这种改善作用比胰岛素单独使用的效果更佳[19]。这些研究结果都表明，C肽可能成为防治糖尿病并发症的有效措施。本研究建立在体T2DOP大鼠模型，通过皮下注射C肽后检测大鼠骨代谢及成骨能力，探讨C肽对2型糖尿病引起的骨质疏松的防治作用。研究结果发现，T2DOP组大鼠血糖水平较Sham组明显升高，证明糖尿病模型建立成功；与T2DOP组比较，C肽(12周)组大鼠血糖水平下降最为明显(P<0.01)，证明C肽对T2DOP大鼠的血糖具有调节作用。Ca、P等矿盐是骨组织钙化的重要成分，其血清和尿液的含量变化可以间接反映出骨矿物质的代谢情况[20]。根据对各组大鼠血清及尿液中Ca、P含量的检测结果，与Sham组比较，T2DOP组大鼠血清中Ca、P含量明显降低，尿液中的Ca、P含量明显升高，差异均有统计学意义(P<0.01)，证明T2DOP大鼠骨矿物质代谢增加；经过C肽不同周期的治疗后，T2DOP大鼠骨矿物质代谢呈时间依赖性显著降低，提示C肽能够减缓甚至改善T2DOP造成的骨矿物质代谢。通过检测大鼠骨生成指标血清中PⅠNP、ALP及OCN水平发现，T2DOP大鼠的骨形成能力降低，而C肽的治疗能够减缓甚至提升大鼠的成骨能力；同时发现，T2DOP大鼠骨胶原降解加速，表现为血清中PⅠNP含量明显降低[21]，血清中CTX-Ⅰ和尿液中DPD的含量明显升高。给予C肽治疗8～12周后，T2DOP诱发的骨吸收被明显逆转，且治疗时间越长改善越为明显(P<0.01)。最后，本研究通过对各组大鼠的股骨BMD、骨组织微结构及股骨的生物力学检测来衡量DOP对大鼠骨组织的伤害及C肽是否能改善这种组织微结构的破坏[22]。结果显示，与Sham组相比，T2DOP大鼠股骨BMD显著降低；与T2DOP组相比，C肽(12周)组大鼠股骨BMD升高最为明显，差异均有统计学意义(P<0.01)。T2DOP组大鼠骨组织微结构破坏严重，而经过12周的C肽干预后，大鼠的骨组织微结构被保护，且结果显著。同时，各组大鼠的股骨生物力学指标检测结果显示，T2DOP组大鼠股骨的最大载荷及弹性模量较Sham组明显降低 (P<0.01)，而C肽干预8～12周后，大鼠股骨的最大载荷及弹性模量呈时间依赖性升高，证明C肽能够增强T2DOP造成的骨强度降低，恢复大鼠的骨强度。

A.最大载荷； B. 弹性模量;与Sham组相比，*P<0.05，**P<0.01；与T2DOP组相比，#P<0.05，##P<0.01 A.maximum load；B.elastic modulus； vs. Sham group, *P<0.05, **P<0.01; vs. T2DOP group, #P<0.05, ##P<0.01图6 C肽对T2DOP大鼠股骨生物力学的影响Fig 6 Effects of C-peptide on the biomechanics of femur of T2DOP rats

综上所述，本研究通过建立在体T2DOP大鼠模型，皮下注射C肽8～12周后发现，C肽能够有效降低T2DOP大鼠血糖水平，改善骨矿物代谢情况，提升成骨能力，减缓甚至逆转T2DOP诱发的骨吸收，增加大鼠股骨BMD，保护T2DOP造成的骨组织微结构破坏，恢复大鼠骨强度，且以C肽治疗12周的效果更为明显。本研究初步验证了C肽对T2DOP大鼠的血糖调节、骨代谢、骨吸收的改善作用及对骨组织BMD、微结构及强度的保护作用，为T2DOP的药物防治提供了新思路，为2型糖尿病并发症的防护提供了药物治疗的新线索。