黄花蒿新品种“研青一号”研究△

丁丹丹，马婷玉，陈士林，冷梁，黄盛群，谢刚，向丽*

1.中国中医科学院 中药研究所/北京市中药鉴定与安全性检测评估重点实验室，北京 100700；2.广西仙草堂制药有限责任公司，广西 柳州 545400

青蒿素是治疗间日疟、恶性疟和抗氯喹疟疾的首选药物[1]，近几年全球青蒿素年用量在180 t左右[2]，虽然早有研究可通过人工合成的方法合成青蒿素[3-4]，但由于成本和效率等问题难以大规模生产[5]，目前主要依靠从黄花蒿植物中提取的方法。除了我国少部分地区外，全球大部分区域的黄花蒿中青蒿素含量都在0.2%以下，不具有提取价值[6-7]。相关研究[8-10]发现，黄花蒿在我国海南、湖南、广西等地适宜生长；重庆、四川等地和低海拔地区黄花蒿抗疟效果较好；海南省降水充沛、光热量足，与黄花蒿高温喜湿的生物学特性一致[8]，野生资源青蒿素含量较高。目前，黄花蒿主要依靠人工栽培，但是不同产地、不同品种黄花蒿中青蒿素含量存在显著差异，生产栽培技术不够规范导致栽培的黄花蒿质量良莠不齐。青蒿酸、双氢青蒿酸、青蒿乙素均是青蒿素生物合成的前体物质[11-12]。课题组经过多年混合选育，获得青蒿素含量高达2.11%的新品种“研青一号”(YQ1)，并对青蒿素及其前体物质进行了含量测定，基于重测序筛选其Indel分子标记，采用药用植物全球产地生态适宜性信息系统(GMPGIS)预测了其适宜种植范围，并总结了规范化栽培技术体系，为降低原料成本、获得高品质青蒿素原料提供保障。

1 材料与方法

1.1 “研青一号”植株形态特征

试验材料包括YQ1以及来自海南栽培种(HQ1)、湖南的栽培种(HUN)以及海南的2个野生种(HN1、HN3)。在采收期(8月中上旬)测量其株高、冠幅、地上茎粗、分枝数、分枝角度、叶片面积及单株干叶质量。叶片面积使用Image J软件对黄花蒿植株一级分枝上叶片进行面积计算，每个品种测量30株。

在种子成熟期，对每个品种随机抽取30粒用于形态观察。首先将种子置于平底玻璃片(5 cm×10 cm)上，在TOUPCAM显微镜4倍视野下观察，使用Toup View软件量取30粒种子的最长、最宽数据并记录；选用体式显微镜拍照观察并描述其形态与差异，见图1。选择百粒法测定黄花蒿种子千粒质量。每个批次随机抽测100粒种子，使用十万分之一天平称定质量，进行6个重复。按公式(1)(2)对不同品种黄花蒿种子的发芽率、发芽势进行测定，将100粒黄花蒿种子均匀洒在实验滤纸上，使之保持湿润，每批样品3次重复。发芽条件：温度20 ℃，相对湿度40%，20%光照8 h。胚根与种子等长或稍长，2片子叶展开者视为正常发芽并统计。连续3 d不发芽视为发芽结束。

发芽率=发芽种子总数/供试种子总数×100%

(1)

发芽势=前5 d发芽种子总数/供试种子总数×100%

(2)

1.2 青蒿素类化合物含量测定

在黄花蒿采收期，对5个品种进行青蒿素、青蒿乙素、青蒿酸和双氢青蒿酸含量测定，每个品种测定30个单株。

采用超高效液相色谱-串联质谱检测法(UPLC-QQQ-MS)进行青蒿素类化合物含量测定。青蒿素(批号：CFS201801，纯度≥99%)、双氢青蒿酸(批号CFS201801，纯度≥98%)、青蒿酸(批号：CFS201702，纯度≥99%)、青蒿乙素(批号：CFN98807，纯度≥98.0%)均购于武汉天植生物技术有限公司；甲醇、乙腈为色谱纯 (美国Fisher公司)；乙酸(分析纯，北京化工厂)；甲酸、甲酸铵(色谱纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；娃哈哈纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司)。Eclipse Plus C18(2.1 mm×50 mm，1.8 μm)色谱柱，美国Agilent UPLC-MS系统[1290系列超高效液相色谱仪、6470 型三重四极杆质谱仪(安捷伦科技有限公司)]；XS105型十万分之一电子分析天平(METTLER TOLEDO公司)；舒美KQ-500DE型数控超声波清洗器(功率100 W，昆山市超声仪器有限公司)；BS210S型万分之一电子分析天平(德国赛多利斯公司)。

取青蒿素、青蒿乙素、双氢青蒿酸、青蒿酸对照品适量，分别精密称定，加甲醇制成对照品溶液。取植物样品适量，粉碎，精密称取0.1 g，置于50 mL离心管中，加入甲醇10 mL。超声提取30 min，放冷后吸取适量溶液稀释1000倍，滤过，即得样品溶液。

注：A.HUN；B.HN1；C.HQ1；D.HN3；E.YQ1。图1 不同来源黄花蒿种子于体视显微镜下的形态

青蒿素、青蒿乙素流动相：0.1%甲酸10 mmol·L-1-甲酸铵水溶液(A)-乙腈(B)；梯度洗脱(0～5 min，5%～100%B；5～7 min，100%B)，后运行2 min。柱温：30 ℃，进样量：1 μL，流速：0.3 mL·min-1。离子源：电喷雾离子源(ESI)，扫描方式：正离子模式，MRM模式进行检测。外标法计算浓度。青蒿素母离子：283.2，子离子：265.1、247.1，电压：135 V，能量：5；青蒿乙素母离子：249.1，子离子：189.1，能量：9，子离子：143.1，能量：24，电压：130 V。

青蒿酸、双氢青蒿酸流动相：0.05%乙酸水溶液(A)-甲醇(B)；等度洗脱(0～3 min，85%B)，后运行2 min。柱温：30 ℃，进样量：1 μL，流速：0.3 ml·min-1。离子源：电喷雾离子源(ESI)，扫描方式：负离子模式，SIM模式进行检测。青蒿酸母离子：233.2，电压：140 V；双氢青蒿酸母离子：235.2，电压：140 V。

以峰面积积分值为纵坐标(Y)，对照品进样浓度(ng·mL-1)为横坐标(X)，绘制标准曲线，青蒿素：Y=729.95X+10 575，r=0.999 9；青蒿乙素：Y=2 327.8X+421.24，r=1；青蒿酸：Y=16 362X+23.033，r=0.999 6；双氢青蒿酸：Y=4 907.8X-7 124.6，r=0.999 8。线性关系良好，精密度、重复性、稳定性试验合格。

1.3 基于重测序的InDel分子标记筛选

1.3.1InDel标记的鉴定及引物设计 使用Burrows-Wheeler Alignmet(BWA)将15个品系比对到基因组上(每个品系2～3个重复，共34个重测序样本)，然后使用GATK流程在比对后的重测序样本中注释出每个品系特异的缺失突变(InDel)。选择YQ1品系的3个重复样本RS4、RS17以及RS30的特异缺失突变，取InDel 位点两翼各500 bp碱基长度，共1000 bp片段长度使用Primer 5.0进行引物设计。上游设计在1～500 bp，下游设计在500～1000 bp，筛选YQ1特征性的缺失突变位点。

1.3.2PCR扩增和电泳 材料来自于7份常规栽培及野生黄花蒿种质资源，包括YQ1、HQ1、HN1、HN3、HUN、GZ(贵州)、XZ(西藏林芝米林县)，2018年种植于北京怀柔实验基地。采取幼苗期叶片，采用基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN Hi-DNAsecure Plant Kit DP350)。PCR 反应体系为25 μL，其中DNA 模板(15 ng·μL-1) 2 μL，2×TaqMix酶(2.5 U·μL-1) 8.5 μL，上游引物(10 μmol·L-1) 1·μL，下游引物(10 μmol·L-1) 1 μL，ddH2O 12.5 μL。PCR 反应程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 10 min；4 ℃保存。6%聚丙烯酰胺凝胶电泳，电压120 V，电泳时间20 min。显色后照相保存。

1.4 “研青一号”全球产地适宜性分析

运用GMPGIS系统对“研青一号”全球适宜生产区域进行预测。根据“研青一号”多点多年试验结果，将海南省、重庆市、四川省、广西省、湖南省等132个试验点经纬度导入GMPGIS系统，生成shape文件，在基础地理信息数据库、气候因子数据库等相关数据库的支持下，进行“研青一号”的生态因子值分析及全球产地适宜性分析。

2 结果与分析

2.1 选育过程

2013年通过收集比较全国黄花蒿野生及栽培种质资源523份，发现来自广西融安县的1份种质资源青蒿素含量较高，>2.0%，同时采用高光照射和组织培养方法，对该品系的植株紧凑、矮化的株系进行保留、扩繁并单独留种。经过3年多技术混合选育，获得平均青蒿素含量达2.11%的新品种“研青一号”，并于2017、2018年在四川省宜宾市、重庆市酉阳县、海南省海口市、广西省融安县、湖南省祁阳县、北京市怀柔县、江苏省无锡市进行了多点试验。

2.2 植株形态特征

“研青一号”植株整体表型较为一致，主要呈圆塔形生长，平均株高为(124.0±25.5) cm，较其他种质资源黄花蒿矮，生育期240～250 d；其株型紧凑，平均冠幅为(93.4±14.0) cm。叶色正绿色，叶片普遍稍大，平均叶片面积为(11.2±3.2) cm2。植株腺毛密度高，气味浓郁，平均单株叶片干质量为(211.9±48.1) g。种子表面圆润，有浅棕色沟纹，基部渐尖，长宽比为2.0±0.1，千粒质量(35.0±1.7) mg。“研青一号”在第3和第4天开始发芽，主要集中于第4天至第6天，第7天和第8天后发芽率开始降低，发芽率为(79.0±10.5)%。因此，“研青一号”植株呈圆塔型，矮小、紧凑、叶片较大，生育期长，能与其他品种进行明显区分(见表1)。

表1 “研青一号”植性状特征及青蒿素含量

2.3 青蒿素类化合物含量测定

由图2可知，与4个对照比较，YQ1青蒿素含量最高，平均为(2.11±0.38)%，最高达2.70%；同时双氢青蒿酸含量也最高，平均为(0.33±0.07)%，最高达0.53%；青蒿乙素和青蒿酸含量却是5个品种中最低的。对照品种内4种化合物含量变化趋势基本一致，青蒿素和双氢青蒿酸含量较高，青蒿酸和青蒿乙素含量较低，青蒿素含量比重最大。HN1青蒿乙素和青蒿酸含量最高，分别为(0.06±0.03)%和(0.02±0.01)%，最高为0.06%。

注：A.青蒿素;B.青蒿乙素;C.双氢青蒿酸;D.青蒿酸。图2 不同黄花蒿中青蒿素、青蒿乙素、青蒿酸、双氢青蒿酸含量测定结果

将植株性状与青蒿素类化合物含量进行相关性分析，青蒿素含量与双氢青蒿酸含量正相关，r=0.625 7。青蒿酸和青蒿乙素含量显著正相关，r=0.834 8。青蒿素、双氢青蒿酸含量与植株的叶面积呈正相关，与株高、冠幅、地上茎粗、分枝数、分枝角度负相关，但相关系数并不显著。植株主要性状与叶片产量相关性分析结果表明，植株产量与株高、冠幅、地上茎粗、分枝数、分枝角度、叶片数皆呈正相关，其中冠幅与产量的相关性最高，r=0.613 5。结合青蒿素含量及植株产量分析，人工培育新品种时可选择植株紧凑，冠幅适中，二级分支数多，叶面积较大的株系。

2.4 特异性、一致性、稳定性分析

特异性：“研青一号”与4个栽培和野生优良品系比较，特异性明显，植株呈圆塔型，植株紧凑、矮小，一级分支和二级分支夹角小，生育期长；青蒿素和双氢青蒿酸含量最高，平均值分别为(2.11±0.38)%和(0.33±0.07)%。

一致性：对“研青一号”主要性状指标变异系数进行分析，其植株形态、叶色、花色、种子颜色全部一致，株高、冠幅、叶面积、一级分支角度、二级分支角度、种子长宽比、种子千粒质量、青蒿素含量、双氢青蒿酸含量等指标的变异系数都符合一致性要求。

稳定性：“研青一号”于2017、2018年在四川省宜宾市、重庆市酉阳县、海南省海口市、广西省融安县、湖南省祁阳县、北京市怀柔县、江苏省无锡市进行了多点试验。除北京市怀柔县基地的样品青蒿素含量有降低外，其余基地植株性状表现较稳定，青蒿素含量均在2.0%以上，稳定性较好。

2.5 基于基因组重测序的 Indel分子标记筛选

重测序及序列比对结果表明，黄花蒿每个品系的缺失突变数量为 76 971～114 174个。“研青一号”3个重复样品RS4、RS17以及RS30的特异缺失突变分别为91 288、96 812、99 827个。随机筛选出InDel标记45条，其中有16条序列的Indel片段>590 bp，对这16条序列进行引物设计，共设计引物32对。以7份黄花蒿材料基因组DNA为模板，用PCR方法检测32对引物有效性。其中AaIn101(AaIn101F：GACTATGTTTAGCGCGGAGC，AaIn101R：TGGCACTACTTTATCATATCAAATC)和AaIn110(AaIn110F1：GTTCTAGACTCGGGCCTTAGC，AaIn110R1：CTGGC-TGTGCCATGTTTCTG)可以在“研青一号”中出现特异条带，而在其他6份材料中无条带(见图3)，可作为“研青一号”的特异分子标记，用于区分“研青一号”和其他产地黄花蒿种质。

注：A.AaIn110；B.AaIn101；1.YQ1；2.GZ；3.XZ；4.HUN；5.HQ1；6.HN1；7.HN3。图3 引物 AaIn101 和AaIn110对7份黄花蒿种质资源的扩增结果

2.6 “研青一号”全球产地适宜性分析

通过对“研青一号”基点的GMPGIS分析，得出“研青一号”主要分布区域的生态因子值范围：最冷季均温4.5～18.9 ℃，最热季均温24.4～28.6 ℃，年均温14.9～24.3 ℃，年均相对湿度68.61%～77.35%，年均降水量987～1688 mm，年均日照124.96～145.47 W·m-2，土壤类型以强淋溶土、高活性强酸土、暗色土、人为土、黑钙土、铁铝土等为最多。

根据以上分析所得到的生态因子值范围，利用加权欧式距离法计算得到“研青一号”的最大生态相似度区域(指相似度99.9%～100%的区域分布图，见图4)。“研青一号”在亚洲的适宜生长区域面积分布较大，多处于亚热带季风和季风性湿润气候。其中，中国适宜性分布区域面积最大，达1 020 446.59 km2、越南占38 609.57 km2、巴西占8 006.91 km2、日本占3 247.25 km2.。

“研青一号”在中国的最大生态相似度区域，主要分布在我国东南部，具体包括广西壮族自治区、湖南、江西、广东、湖北、浙江、福建、四川、贵州、重庆、海南等。其中面积最大的为广西壮族自治区，适宜性分布区域面积达211 656.27 km2。根据GMPGIS分析结果可得，在我国东南部地区较适宜“研青一号”生长。

注：审图号为GS(2020)2680号。图4 “研青一号” 99.9%～100%最大生态相似度区域分布

3 “研青一号”无公害规范化栽培技术

3.1 种子繁殖

3.1.1选地与整地 “研青一号”生活能力较强，喜温，根据多点试验及GMPGIS分析结果，选择我国东南部海拔在800 m以下林缘、荒地，气候潮湿向阳，排水良好，疏松肥沃的沙壤土，未连作地块来进行种植较好。

播种前，对苗床进行精细耕作，使土地平整，土壤疏松，然后浇水使土壤润透，制作宽1.2 m、高20 cm的垄面，排水沟宽30 cm。

3.1.2播种时间 海南最佳育苗时间为11—12月；其余地区在1—2月播种较好。

3.1.3播种方法 播种前将种子与沙土拌匀，每1 g种子用4000～5000 g干细泥沙，然后均匀洒向床面，播种完成后，在苗床表面加播一层薄薄的草木灰，以遮住种子为度，再在苗床上覆盖一层地膜，以保持温度，便于种子萌发。每1 g种子可播15 m2，可种2664～3996 m2。

3.1.4苗床管理 播种7 d后，要勤时揭膜，观察苗床情况，通过揭膜通风和及时洒水使之保持合适的温湿度。种苗长到5 cm左右时可将地膜去掉，从苗床两端先撤，通过炼苗提高种苗的生长适应能力。

炼苗期间视情况而定，可用1.5 L水配50 g尿素加150 g复合肥配成的尿素水或者经30%稀释的农家肥催苗，施水肥后需用清水补淋1次，苗高10～15 cm主茎变硬时即可进行大田移栽。

3.2 移栽定植

3.2.1移栽时间 3—4月。

3.2.2选地整地 选择气候温暖向阳，排水良好，疏松肥沃的沙壤土地，土地翻耕后，起厢宽1.2 m，起垄宽0.6 m、高0.3 m，沟宽0.4～0.5 m。坡地耕后可直接种植，但注意不能种在起沟起槽的凹地处。每株移栽前在距根部4.5～6 cm间施100 g有机肥和30～40粒复合肥(硫酸钾型15+15+15)混合作底肥。

3.2.3拔苗移栽 当苗长到10～15 cm时，选择在晴天下午或阴天按1 m×0.9 m间距移栽。若苗床干结，用清水淋湿后再拔苗，当天种完。种植深度3～5 cm，种植后及时浇透定根水，保证成活率。

3.3 田间管理

种苗存活后，可在40、70 d左右生长期中进行第2次、第3次施加专用复合肥，每666 m2施加2 kg，沿植株冠幅边缘垂直线挖穴、放肥、盖土3～4 cm，避免肥料挥发流失及烧苗。移栽后及时检查种苗的存活情况并补苗，移栽初期及时清理杂草，后期由于植株生长旺盛，可不用考虑除草问题。“研青一号”在排水不良的潮湿地带生长较差，干旱时期要及时浇水，雨季则注意清沟、防渍排涝。

3.4 病虫害防治

“研青一号”病虫害并不严重，但在栽培过程中，由于连作[13]、气候变化、通风差[14-15]等原因可能会出现部分病虫害，主要病虫害为茎腐病、白粉病、黄萎病、蚜虫、小地老虎等。

3.4.1病害防治 茎腐病在高温多雨时节较易发生，根皮部及茎内木质部发黑、脱落，在发病初期可以喷淋1%硫酸亚铁溶液、70%甲基托布津500倍液，隔7～10 d喷1次防治，防治2～3次。

白粉病主要发病期在6—7月，白粉遍布全株，由老叶向新叶发展，可用可湿性粉锈灵兑水500～800倍进行喷雾防治。

黄萎病主要发病期在6—7月雨后高温天气时，染病植株从下部一些叶片开始黄化，逐渐向上扩展，最终导致整个植株黄萎病死。发病初期施用50%多菌灵可湿性粉剂450倍液，隔7～10 d喷1次防治，防治2～3次。

3.4.2虫害防治 蚜虫常大量附着在嫩叶、茎尖部位，可用20%速灭丁或蚜虱净等喷雾防治；小地老虎会将苗床内或刚移栽至大田的幼苗近地面茎部咬断，造成整株病死，每666 m2可用90%敌百虫30倍水溶液150 mL拌5 kg菜叶、鲜草制成毒草进行诱杀。

3.5 采收与储藏

“研青一号”大量采收时，选择晴天早上将全株从基部割倒，在晒场或屋檐下晾晒或阴干，待叶变为褐色且质地呈焦脆状时，可用棒敲或老式打谷机将叶子打下来，挑去小枝梗和杂质，打包装袋，于避光通风处保存。

4 讨论与展望

青蒿素作为抗疟一线药物，属于我国战略资源[16]。“研青一号”经长期选育，在栽培过程中表型渐为稳定，株型紧凑，青蒿素含量平均值较高。采用分子标记可以快速辅助药用植物品种选育[17-19]。参考黄花蒿全基因组信息[20]，基于34份重测序分析，筛选获得2对特异性 InDel引物，可区分 “研青一号”与其他产地的黄花蒿种质资源。由于黄花蒿为异花授粉植物，且野外存在大量黄花蒿资源，因此在栽培过程中容易发生退化，虽然现在黄花蒿品种青蒿素含量已经较前期(0.8%)提高了2～3倍，但后期需要进行持续优化，保持品种的稳定性和优良性，并通过规范化种植，保持我国在青蒿素原料方面的优势地位。