双参颗粒散剂及水煎剂入血成分差异的初步分析

魏华民 章从恩 李杨帆

摘要 目的：初步分析大鼠口服双参颗粒散剂与水煎剂后的入血成分差异。方法：采用LC/MS-IT-TOF方法对双参颗粒醇提取物、水提取物含藥血清、散剂含药血清进行分析，根据保留时间、精确相对分子质量，质谱数据等完成各组成分差异比较。结果：和水煎剂比较，初步鉴定出双参颗粒散剂特有的4个原型吸收入血成分，分别是Ginsenoside-Rh1，Ginsenoside-Rg2，Ginsenoside-Rb2和Ginsenoside-Rg3。结论：双参颗粒散剂和水煎剂在大鼠入血成分存在差异，这些入血成分可能是双参颗粒散剂异于水煎剂在血中起直接作用的物质。

关键词 双参颗粒;入血成分;散剂;水煎剂;LC/MS-IT-TOF

Abstract Objective：To preliminary analyze the plasma effective components Difference of rats after intragastric administration of Shuangshen Granules（SSG）.Methods：The liquid-mass spectrometer-ion trap-time-of-flight mass spectrometry （LC/MS-IT-TOF） method was used to analyze the medicated serum of Shuangshen Granules pulvis and water decoction，according to the retention time，accurate relative molecular mass，mass spectrometry data，etc.the components differences between groups were compared.Results：Compared with water decoction，there are 4 plasma effective components of Shuangshen Granules Pulvis：Ginsenoside-Rh1，Ginsenoside-Rg2，Ginsenoside-Rb2 and Ginsenoside-Rg3.Conclusion：Different plasma effective components were found between pulvis and water decoction of SSG after intragastric administration by rats，different from water decoction，these plasma effective components may be substances in which pulvis plays a direct role in blood.

Keywords Shuangshen Granules; Plasma effective components; Pulvis; Water decoction; LC/MS-IT-TOF

中图分类号：R284;R285 文献标识码：A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.16.001

双参颗粒是中国中医科学院广安门医院花宝金教授的发明专利（国家发明专利：201310091864.4），由西洋参、三七及冬虫夏草组成，以散剂口服为主，主要用于防治肺癌的复发和转移[1]，我们的前期实验发现双参颗粒对肺转移前微环境的形成有较强的干预作用，并且发现散剂明显优于水煎剂[2-3]，所以研究双参颗粒的入血成分对分析双参颗粒干预肺转移前微环境是重要的补充，而且双参颗粒的基础研究仍较为薄弱，特别是其药效物质基础尚不明确，这些都在一定程度上影响了双参颗粒的合理开发和使用。所以本研究进一步对本批次双参颗粒进行了质谱分析，为阐明其散剂的有效性及进一步研究其入血成分以肺及骨髓微环境的作用提供基础。

中药成分复杂，通过口服给药，真正入血的成分才有可能是中药的药效物质基础，分析和寻找口服后能够入血的原型成分及代谢产物，才能够为阐明其药效物质基础提供一定的依据[4-6]。因此，本实验利用LC/MS-IT-TOF技术初步分析双参颗粒血中移行成分并与水煎剂比较，以阐明其在体内的直接作用物质基础，为双参颗粒的药代动力学和质量控制研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 健康SD大鼠，体质量200～240 g，雄性，购自北京维通利华实验动物技术有限公司（实验动物合格证号：大鼠11400700375241），大鼠饲养于首都医科大学附属北京友谊医院实验动物中心[实验室合格证号：SYXK（京）2017-0019，动物实验伦理审批号：18-2031]，分笼饲养，每笼4只，保证大鼠有充足的活动空间。自由饮水及进食，饲养期间维持室内温度（25±2）℃，相对湿度约为（50±2）%，通风良好、环境安静，模拟自然条件维持每12 h/12 h昼夜灯光交替，饲料为实验室提供大鼠专用饲料，每周换笼清洁至少2次。

1.1.2 药物 双参颗粒药材（西洋参、冬虫夏草、三七）采购自华邈药业有限公司（生产批号分别为：20180201，20180217，20180119）。双参颗粒提取物（自制），水为自制超纯水，甲醇（Fisher Scientific公司，货号：950055）、乙腈为色谱纯（Fisher Scientific公司，货号：TS-51101），其余试剂均为分析纯。

1.1.3 试剂与仪器 高效液相色谱-离子阱-飞行时间串联质谱仪（岛津Shimadzu，日本，型号：LC-MS-IT-TOF）;Radient A10 Mill-Q超纯水器（Millipore公司，美国，型号：Radient A10）;冷冻离心机（Sigma，德国，型号：3-18k）;微量分析天平（Mettler Toledo，瑞士，型号：AL204）。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件 色谱柱为Waters XBridge C18（2.1 mm×150 mm，3.5 μm），流动相0.1%甲酸水溶液（A）-0.1%甲酸乙腈溶液（B）梯度洗脱（0～3 min，5% ～8% B;3～6 min，8% ～10% B;7～15 min，10% ～30% B;15～25 min，30% ～60% B;25～30 min，60% ～95% B;30～35 min，95% B;35～40 min，95%B），流速1 mL/min，柱温40 ℃，进样量5 μL。

1.2.2 质谱条件 电喷雾离子源，扫描方式为负离子扫描（m/z 100～1 000），毛细管电压4.5 kV，锥孔电压150 V，离子源温度110 ℃，雾化气（N2）压力0.12 MPa，雾化气温度200 ℃，流速8.0 mL/min。

1.2.3 双参颗粒提取物制备 通过本课题组前期药效学试验优选并确定了双参颗粒提取物的制备工艺。取双参颗粒药材（西洋参、冬虫夏草和三七粉混合物）100 g，加8倍量70%乙醇提取3次，提取时间分别为1.5 h、1.0 h、1.0 h，过滤，合并滤液，减压浓缩至1 g/mL（以生药量计），加1倍量水饱和的正丁醇溶液萃取3次，合并正丁醇液，减压回收正丁醇，45 ℃真空干燥，即得。

1.2.4 供试品溶液的制备 取双参颗粒提取物粉末（过三号筛，下同）0.1 g，精密称定，加入50%甲醇10 mL，超声10 min，12 000 r/min，离心半径10 cm，低温（4 ℃，下同）离心10 min，取上清液，即得。

1.2.5 血清的制备 取清洁级SD大鼠，雄性。随机分成水煎剂组和颗粒组，每组6只。禁食12 h，但自由饮水。根据双参颗粒常用剂量和课题组前期开展的药效学实验，以及血清药物化学预实验的结果，选择50 g/kg（以生药量计）作为给药剂量灌胃给予双参颗粒提取物，于给药后30 min后尾静脉采血，取全血置于37 ℃水浴保温至上层有淡黄色液体析出，取出后于离心机中3 000 r/min，离心半径10 cm，低温离心10 min。取上层血清，将同一组各血清混合，以消除个体差异，置于-20 ℃保存，备用。

1.2.6 血清样品的处理 取2组含药血清各600 μL，依次加入10%甲酸水溶液120 μL和甲醇2.4 mL，涡旋混合2 min，超声5 min，低温离心（12 000 r/min，离心半径10 cm，离心10 min）。随后取上清液置氮吹仪中，37 ℃下吹干。残留物加入50%甲醇150 μL复溶，涡旋1 min，超声10 min，低温离心，取水煎剂含药血清样品、颗粒剂血清样品，供血清药物化学研究。

2 结果

2.1 图谱的采集 根据1.2.1与1.2.2项下条件，采用正负离子模式对双参颗粒提取物、水煎剂含药血清和颗粒剂血清样品进行数据采集，以颗粒剂醇提取物为对照，分析散剂含药血清及水煎剂含药血清中药物成分的差异。见图1、2。

2.2 双参颗粒入血成分的分析与鉴定 根据1.2.1与1.2.2项下条件，比较双参颗粒醇提取物样品液、双参颗粒水煎剂含药血清和双参颗粒散剂血清的差异色谱图发现，双参颗粒提取物含药血清中出现了8个入血成分。见表1。其中4个为文献报道的原型收入血成分。见表2。典型的Rg2/3质谱图见图3。主要入血成分质谱见图4。

3 讨论

中药有丸散膏丹等不同传统剂型，每种剂型都有不同的适应证，根据临床需要适时选用，其中散剂和汤剂都是临床常用的药剂类型，各有特点而在临床使用方面不能完全相互替代。有研究显示中药传统剂型五苓散要比相同药物的水煎剂效果更好[7-10]，这说明散剂有其特殊的临床价值。双参颗粒作为预防肺癌术后复发转移的有效方剂，也是作为散剂口服应用。我们在前期动物及细胞实验研究中发现，双参颗粒散剂、水煎剂及醇提剂有着显著的效用差异[3]，所以本研究通过建立LC/MS-IT-TOF对双参颗粒含药血清的检测方法，主要比对双参颗粒散剂和水煎剂的入血成分差异，该方法可合理的将超高效液相色谱强大的分离能力和质谱的高分辨特点运用在复方中药体系中，具有离子传输效率高、灵敏度高、重复性高等优点[11-12]。由于有些生理反应是在血液中完成的，所以研究中药复方的入血成分对这些过程干预机制研究有重要意义[13]。有研究发现在荷瘤小鼠，骨髓细胞向髓源性抑制细胞的分化过程就是在血中完成的，在接近靶器官的时候血中的骨髓细胞完成分化，使得髓源性抑制细胞在靶器官定植并改善局部的免疫抑制微环境从而导致循环肿瘤细胞的远端转移[14]。我们的前期研究发现，双参颗粒散剂和水煎剂比较可以显著降低肺转移前微环境中髓源性抑制细胞的比例（结果未发表），这有可能是某些入血成分干预了髓系细胞分化的过程所致，所以本研究重点分析了不同时间点散剂和水煎剂入血成分的差异。

我们给大鼠灌胃双参颗粒水煎剂和颗粒剂后，分别考察30 min、1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h、7 h、8 h、10 h血清的质谱信息，通过对不同样品的色谱图峰强度、峰数目及入血峰面积等结果进行对比，还分别采用正、负离子扫描方式对双参颗粒提取物样品液进行全扫描，结果发现在正负离子模式下双参颗粒提取物样品液中的化合物響应均较高，并且各色谱峰之间实现了较好的分离。本研究通过对比双参颗粒提取物、水煎剂含药血清、颗粒剂含药血清指纹图谱，进行水煎剂含药血清与颗粒剂含药血清的差异图谱分析，从血清中检测出8个入血成分，其中4个为原型成分。根据质谱所提供的保留时间、精确相对分子质量的比较，鉴定出了其中的4个原型吸收入血成分，分别是Ginsenoside-Rh1，Ginsenoside-Rg2，Ginsenoside-Rb2和Ginsenoside-Rg3。根据本实验的研究结果，我们推测上述4个原型成分可能是散剂优于水煎剂效果的物质基础，是双参颗粒散剂在体内发挥药效的有效组分群，既往的研究证实人参/三七皂苷不仅具有一定的抗氧化、抗炎和抗凋亡作用，而且可以上调造血细胞增殖的相关基因，通过JAK2/STAT5促进人CD34+细胞向红系分化[14-18]，增加骨髓中间充值干细胞内的碱性磷酸酶的水平[19]，且具有一定的促进骨髓细胞分泌诸如GM-CSF的细胞因子[20-21]的作用，正是由于人参皂苷对骨髓微环境中的细胞、细胞内代谢及细胞分泌因子均具有影响作用，所以我们推测上述4种成分可能是双参颗粒散剂抑制血液细胞成分分化从而干预转移前微环境的效用成分。但由于实验方法有限，可能存在某些极性小的或者不能电离的化合物不能被检测到的情况，当然也需要后续进一步的实验来证实化合物成分，本实验在一定程度上为双参颗粒的后续药理活性和药代动力学研究提供了实验依据，也可为阐明双参颗粒药效物质基础及作用机制提供参考，为精准治疗药物的开发奠定了部分实验基础。

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（2019-12-24收稿 責任编辑：王明）