CHO细胞生产蛋白糖基化影响的研究

摘 要： 蛋白质的糖基化对于其作为生物治疗剂至关重要，已经展开了许多对中国仓鼠卵巢细胞生产蛋白糖基化的研究。生物过程参数和培养基添加剂可调节蛋白质的糖基化。本文介绍了工程策略方面的进展。

关键词： CHO细胞;糖基化;蛋白

中国仓鼠卵巢（CHO）细胞被广泛用于生物治疗药物的生产中，部分原因是它们能够产生糖基化的蛋白质。糖基化通过影响分子的半衰期和效率而在蛋白质功能中起关键作用，并有可能对糖蛋白的安全性产生不利影响[1]。研究人员采用不同的方法包括改变工艺条件、补充培养基添加剂以及宿主细胞系的修饰来调节蛋白质分子的糖基化谱。

糖蛋白通常是指各种翻译后修饰，尤其是蛋白质N-糖基化，它对蛋白质的功效和免疫原性起着至关重要的作用。蛋白质功能受糖基化作用，在结合、溶解度、稳定性和折叠等方面有影响。

1 通过工艺优化控制糖基化

通过优化工艺条件如溶解氧（DO）、pH、温度和培养持续时间等从而影响蛋白质的糖基化。

Chotigeat及其同事发现，将重组人CHO的卵泡刺激素（hFSH）的表达受β肌动蛋白启动子控制的重组CHO细胞系在无蛋白质培养基上稳定灌流培养。增加DO浓度提升了唾液酸转移酶的活性，FSH亚型向较低的pI部位转移，这使得唾液酸含量的增加。随着hFSH比生产率的增加，其亚型分布向低pI亚型转移[2]。

相反，对Epo-Fc融合蛋白[3]和rEPO[4]的研究发现DO对唾液酸化没有影响。对表达EPO的CHOK1细胞的进一步研究表明，DO对触角程度没有影响，但是有一个最佳的DO范围可使岩藻糖基化最大化。对于IgG1的末端半乳糖基化，随着DO浓度的降低观察到聚糖链半乳糖基化程度降低[5]。

CHO培养过程中向较低培养温度的转变也会影响糖基化。使用表达人组织型纤溶酶原激活剂（t-PA）的CHO细胞进行的研究与多糖位点占有率的增加和温度的降低相关[6]。对高度糖基化融合蛋白Epo-Fc的研究中确定降低培养温度会降低产物唾液酸化。对表达人EPO的DUXB11细胞的类似研究发现，低于32°C的温度会导致四唾液酸化的N-聚糖，酸性同工型和四触角结构减少。

对于在中国仓鼠卵巢（CHO）细胞中表达的两种不同的重组糖蛋白，重组人组织纤溶酶原激活剂（t-PA）和重组酶（糖蛋白2-GP2）。这两个分子都包含一个可变占据的N-糖基化位点。Martin Gawlitzek等研究了影响这些分子位点占据的不同环境因素（占位点的程度）。向培养基中添加额外的锰或铁会使完全占据的t-PA（I型t-PA）的比例增加约2.5-4%。将培养温度从37℃降低到33℃或31℃，t-PA的位点占用率提高4%。对于重组酶（GP2），发现培养pH和丁酸盐添加的时间可用于将N-聚糖位点占用控制在特定范围内。培养液pH值的升高与位点占用率的降低相关。这些结果显示了细胞培养条件和培养基成分影响哺乳动物细胞培养物中表达的重组糖蛋白的产品质量的重要性。

2 培养基成分补充

除了优化细胞培养条件外，补充培养基也是调节蛋白质糖基化的一个重要研究领域。CHO细胞产生的嵌合重链抗体（EG2）的糖基化模式受培养物中葡萄糖降解的影响，非糖基化mAb的比例随着细胞暴露在葡萄糖耗尽的培养基中的时间而增加。

Jintao Liu发现有限的核苷酸糖前体和细胞外唾液酸酶不影响唾液酸含量的降低。寡糖分析表明缺乏蛋白质半乳糖基化是唾液酸含量降低的潜在原因;通过在2 L生物反应器中对半乳糖的补充，显示总唾液酸含量增加了44%，在CHO-GS宿主中表达的Fc融合蛋白的唾液酸化多糖含量增加了20.3。在最近的研究中，锰被证明在葡萄糖限制的培养基中添加时可以增加M5高甘露糖聚糖。

3 展望

新型基因组编辑工具的出现开辟了细胞系工程领域，并为工程化CHO细胞产生的治疗药物的糖基化提供了许多选择。随着用于评估聚糖谱的分析方法的不断改进，准确地分离具有高比生产率和所需糖型的克隆的能力将得到改善，优化细胞系发育从而生成具有目标糖基化谱的克隆。

参考文献：

[1]Rudd P M，Elliott T，Cresswell P，et al.Glycosylation and the Immune System[J].Science，2001，291（5512）：2370-2376.

[2]Chotigeat W，Watanapokasin Y，Mahler S，et al.Role of environmental conditions on the expression levels，glycoform pattern and levels of sialyltransferase for hFSH produced by recombinant CHO cells[J].Cytotechnology，1994，15（1）：217-221.

[3]Trummer E，Fauland K，Seidinger S，et al.Process parameter shifting：Part II.Biphasic cultivation—A tool for enhancing the volumetric productivity of batch processes using Epo-Fc expressing CHO cells[J].Biotechnology and bioengineering，2006，94（6）：1045-1052.

[4]Restelli V，Wang M D，Huzel N，et al.The effect of dissolved oxygen on the production and the glycosylation profile of recombinant human erythropoietin produced from CHO cells[J].Biotechnology and bioengineering，2006，94（3）：481-494.

[5]Kunkel J P，Jan D C H，Jamieson J C，et al.Dissolved oxygen concentration in serum-free continuous culture affects N-linked glycosylation of a monoclonal antibody[J].Journal of Biotechnology，1998，62（1）：55-71.

[6]Gawlitzek M，Estacio M，Tobias Fürch，et al.Identification of cell culture conditions to control N‐glycosylation site‐occupancy of recombinant glycoproteins expressed in CHO cells[J].Biotechnology & Bioengineering，2009，103（6）.

作者簡介： 杜秀冬，男，汉族，河北宣化人，本科，工程师，研究方向：医疗工程。