多功能纳米氧化铈量子点对HepG2细胞光疗效应的研究

张李栋，李宏，陈军，黄可，毛应华，荣曙，汪春晖

0 引言

恶性肿瘤是我国的常见病多发病[1]，是世界各地发病率和死亡率高的主要疾病[2]，传统疗法对恶性肿瘤的疗效有限,并对机体造成严重的不良反应。近年来，光动力疗法（PDT）成为肿瘤研究领域关注的热点[3]，可以克服传统疗法存在的缺陷。PDT是通过光敏剂在特定波长激光照射下，与氧分子发生光敏作用产生大量单线态氧（1O2）和ROS，损伤靶细胞[4-5]，而肿瘤的缺氧微环境严重限制了PDT的发展。

近年来，纳米药物的发展提高了抗肿瘤药物的疗效，降低了肿瘤药物的系统毒性[6]。其中，纳米氧化铈（Cerium oxide nanoparticles,CNPs）可以在肿瘤酸性微环境下发挥氧化作用杀伤肿瘤细胞，而在正常细胞的生理pH下，则发挥抗氧化剂保护效应。Pirmohamed等[7]发现CNPs具有过氧化氢酶模拟活性，可以催化肿瘤微环境中的H2O2生成O2，提高PDT的疗效[8]。纳米技术的发展开启了光动力疗法的新时代[5]，通过CNPs加载光敏剂进行恶性肿瘤的光动力学治疗将是一种很好的抗肿瘤策略。然而，未经表面修饰的CNPs由于容易团聚、易被ERS清除、肝细胞毒性等缺点限制了其临床应用。Zeng等[9]合成了透明质酸介导的多功能纳米氧化铈复合材料（HACQDs-Ce6），提高了CNPs颗粒的稳定性，降低对人正常肝细胞的毒性，但其是否对肝癌细胞有毒性作用并未进行探讨。

鉴此，本文进一步研究了多功能纳米氧化铈复合材料（HACQDs-Ce6）对肝癌细胞HepG2的光疗效应，同时从BALB/c小鼠中诱导分化出骨髓源树突状细胞（BMDC），探究HACQDs-Ce6对DC细胞可能造成的影响，并用皮肤成纤维细胞HFF-1、小鼠皮下结缔组织细胞L Wnt-3A进一步评估了HACQDs-Ce6材料的安全性，为恶性肿瘤的治疗提供新策略。

1 材料与方法

1.1 材料

HACQDs-Ce6（由陆军军医大学复合伤研究所惠赠），Anti-CD11c-FITC（Invitrogen公司，美国），重组GM-CSF和重组IL-4（Invitrogen公司，美国）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 人肝癌细胞HepG2、人皮肤成纤维细胞HFF-1、小鼠皮下结缔组织细胞L Wnt-3A购自中国科学院细胞库，细胞用含10%胎牛血清（FBS）（Invitrogen公司，美国）、100 u/ml青霉素、100 μg/ml链霉素的DMEM培养基（Invitrogen公司，美国），在37℃、5%CO2的培养箱中培养。

1.2.2 HACQDs-Ce6的催化产氧能力测定 取30 ml 0.1 mol/L H2O2放入50 ml离心管中，氮气吹干仪通入N2排除溶液中的溶解氧。HACQDs-Ce6组加入1 ml HACQDs-Ce6，对照组加入1 ml PBS。加入10 ml食用油隔绝空气，溶解氧仪每隔20 min测定溶解氧并记录。

1.2.3 CCK-8法检测细胞增殖抑制率 取对数生长期的HepG2/HFF-1/L Wnt-3A/DC细胞，按1×104个/孔接种于96孔板中，孵育24 h后每孔加入5 µl不同浓度的HACQDs-Ce6，使材料中Ce的当量浓度分别为：0、0.125、1.25、12.5和125 µg/ml，孵育24 h后用PBS清洗3遍，更换培养基。光照组细胞用660 nm NIR（200 mW/cm2）照射5 min，黑暗组不作处理，继续培养24 h后每孔加10 µl CCK-8溶液，1 h后测定450 nm处各孔吸光度（OD）值。

1.2.4 划痕实验检测HACQDs-Ce6对HepG2细胞迁移的影响 HepG2细胞按1×105个/孔接种于6孔板中，孵育24 h后用10 µl无菌吸管尖端刮除融合单层细胞，PBS清洗2遍。实验组加50 µl HACQDs-Ce6，对照组加等体积PBS。24 h后PBS清洗3遍，更换培养基。光照组细胞用660 nm NIR（200 mW/cm2）照射5 min，黑暗组不作处理。划痕后0、24和48 h对细胞进行拍照，计算创面愈合率，观察各组细胞创面愈合情况。创面愈合率计算：愈合率=（原始创面面积-未愈合创面面积）/原始创面面积。

1.2.5 活死细胞染色 HepG2细胞按1×105个/孔接种于6孔板中，过夜贴壁；实验组加入50 µl HACQDs-Ce6，对照组加等体积PBS；孵育24 h，取10 µl Calcein AM（1 mg/ml）及15 µl PI（1 mg/ml）溶液，加入5 ml PBS配制成工作液；各孔加入400 µl工作液混匀，37℃下避光孵育20 min，荧光倒置显微镜观察并拍照（Calcein AM:Ex/Em=490/515 nm；PI:Ex/Em=535/617 nm）。

1.2.6 骨髓源树突状细胞（BMDC）诱导培养 取BALB/c雌性小鼠的股骨和胫骨，依次浸泡于无菌PBS 2 min，RPMI1640培养液（3倍青链霉素混合液）5 min，骨髓细胞悬液用200目细胞筛过滤后离心10 min（1 200 r/min），弃上清液，红细胞裂解液裂解3 min，弃上清液，RPMI1640完全培养液（含10%胎牛血清、rm GM-CSF（20 ng/ml）、rmIL-4（10 ng/ml）重悬细胞），以2×106个/孔接种于6孔板中。培养48 h后弃悬浮细胞，隔天半量换液，5天后收集悬浮细胞即为树突状细胞（DCs）。

1.2.7 骨髓源树突状细胞（BMDC）的鉴定 收集悬浮DC细胞，离心5 min（1 200 r/min），弃上清液，PBS重悬细胞，调整浓度至1×107个/毫升，每管加入100 μl细胞悬液，加入5 µl Anti-CD11c-FITC抗体，空白组不作处理，4℃下避光孵育30 min，孵育完毕后PBS清洗3遍，流式细胞仪上机检测。

1.3 统计学方法

用SPSS16.0软件包进行统计分析，以三次实验结果的均数±标准差（）表示，两组均数间比较采用独立样本t检验，多组均数间比较采用单因素方差分析（ANOVA），P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HACQDs-Ce6的体外催化产氧能力

溶解氧仪测定结果显示，HACQDs-Ce6组的溶解氧显著高于PBS组，差异有统计学意义（P<0.001），见图1。

图1 HACQDs-Ce6体外催化产氧能力Figure 1 Catalytic oxygen production capacity of HACQDs-Ce6 in vitro

2.2 HACQDs-Ce6结合PDT对HepG2/HFF-1/L Wnt-3A细胞生长的影响

HepG2细胞活力随着HACQDs-Ce6浓度的增加而下降；HACQDs-Ce6浓度>0.125 μg/ml时，光照组与黑暗组差异有统计学意义（P=0.018）；黑暗条件下HACQDs-Ce6对HFF-1/L Wnt-3A细胞活力几乎无影响（均P>0.05），见图2。

2.3 HACQDs-Ce6结合PDT对HepG2细胞迁移的影响

培养24 h后，PBS和HACQDs-Ce6组中HepG2细胞划痕愈合率为（10.77±0.21）%和（7.48±0.19）%，组间差异有统计学意义（P=3.4E-5）；光照后继续培养24 h,PBS和HACQDs-Ce6组中HepG2细胞划痕愈合率为（21.54±0.29）%和（9.20±0.56）%，组间差异有统计学意义（P=4E-6）；HACQDs-Ce6结合PDT的条件下，HepG2细胞迁移能力明显下降，见图3。

2.4 HACQDs-Ce6对HepG2细胞存活状态的影响

HACQDs-Ce6和PDT联合作用下，几乎能杀死所有HepG2细胞，见图4。

2.5 BMDC的诱导培养及鉴定

采用IL-4和GM-CSF联合诱导BMDC，骨髓源单核细胞逐渐变大，表面变粗糙。从悬浮到贴壁再到悬浮，收集DC。流式鉴定结果CD11c阳性纯度达到96.5%，见图5～6。

图2 CCK-8检测HepG2/L Wnt-3A/HFF-1细胞的生长情况Figure 2 Growth of HepG2,L Wnt-3A and HFF-1 cells detected by CCK-8

图3 划痕实验检测HepG2细胞的迁移情况 (×100)Figure 3 Migration of HepG2 cells detected by wound scratch assay (×100)

图4 Calcein AM/PI细胞双染荧光图像 (×100)Figure 4 Double staining fluorescent images of living(green)/dead (red) cells by Calcein AM/PI (×100)

图5 骨髓源树突状细胞的诱导培养 (×200)Figure 5 Induction culture of bone-marrow-derived dendritic cells (×200)

图6 骨髓源树突状细胞的鉴定Figure 6 Identification of bone-marrow-derived dendritic cells

2.6 HACQDs-Ce6对DC细胞的影响

结果表明黑暗条件下不同浓度的HACQDs-Ce6对DC细胞活力几乎无影响（P>0.05），见图7。

图7 CCK-8检测树突状细胞的生长情况Figure 7 Growth of dendritic cells detected by CCK-8

3 讨论

癌症发病率和死亡率的普遍上升导致了人们对有效和安全的治疗材料的渴望[10]。光动力学疗法（PDT）是一种基于活性氧（ROS）诱导的临床癌症治疗模式[11]，具有组织特异性强、不良反应小等优点[12]。纳米技术的发展使光动力学疗法在肿瘤治疗方面取得了实质性进展，基于纳米材料的PSs载药系统逐渐成为PDT研究领域关注的热点。肿瘤酸性微环境下，CNPs可诱导肿瘤细胞发生氧化应激，导致细胞膜破裂，从而杀伤细胞。此外，CNPs具有强大的储氧能力和过氧化氢酶模拟活性，极大的提高了PDT的治疗效应。

前期，Zeng等[9]已经发现HACQDs-Ce6对正常肝细胞（LO2）无毒性作用，在此基础上，本课题进一步研究了HACQDs-Ce6对肝癌细胞HepG2的光疗效应。结果显示HACQDs-Ce6结合PDT几乎能够杀死大部分HepG2细胞，且对正常细胞无毒性作用，有望解决传统治疗方法的不良反应大、治疗效果不明显等缺陷，为恶性肿瘤患者的治疗提供一种新的策略。

虽然HACQDs-Ce6的光疗效应表现出很好的抗肿瘤效应，但该治疗方案依旧存在两点不足：第一，由于激光组织穿透性较差，临床上对深层肿瘤进行有效的光照依旧困难；第二，CNPs的载氧能力有限，其O2的储备无法满足多轮PDT的治疗。因此，如何更好的将该材料进一步应用于临床，为肿瘤患者提供新的治疗策略还有待进一步探索。