响应面优化红蓝草总酚酸的提取及其抗氧化活性研究

韦正，赖红芳，彭丽娟，覃国乐，黄秀香

（河池学院化学与生物工程学院，广西宜州546300）

红蓝草[Peristrophe baphica（Spreng.）Bremek，PB]是爵床科观音草属植物，又称为红丝线，有红蓝、山蓝、观音草、野靛青之称[1]，主要分布在我国的广西、广东、云南、海南等省区，采收时一般是在夏季，它的全草具有药用价值，具有凉血止血、消肿止痛、清肺止咳[1-2]的功效。在民间，毒蛇咬伤、中暑、扁桃体炎、伤风、气喘、小儿惊风均用红蓝草来治疗[3]。在食品上，它的汁液是做“红色糯米饭”的原料，工业上用来制作“红兰酒”[4]。红蓝草主要含有酚酸类、黄酮类、多糖、生物碱、三萜、甾体及其苷类、苯丙素类、挥发油等化学成分[5]，其中酚酸类物质（原儿茶酸、5-羟基异香草酸、对乙烯基愈创木酚等）具有一定的抗氧化活性[6]。

红蓝草在少数民族地区用作为“五色糯米饭”其中的一种天然的有机染料，其亦为明显药理作用的中草药[7-9]，其酚酸类的提取工艺及抗氧化活性研究未见报道。前期预试验及文献整理研究发现，红蓝草中亦含有酚酸类有效成分[5]，本试验对红蓝草总酚酸进行研究，采用星点设计-响应面法（box-behnken design，BBD）模型设计优选出较佳的总酚酸的提取工艺，采用体外抗氧化活性评价方法进行试验，以期为植物染料红蓝草的研究开发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

红蓝草：采摘于广西宜州市刘三姐乡六妹村，经河池学院覃国乐副教授鉴定为爵床科观音草属Peristrophe baphica（Spreng.）Bremek红蓝草的茎叶。将红蓝草药材洗净、晒干、粉碎、过五号筛，放入干燥缸保存，备用。

1，1-二苯基-2-苦基肼自由基（DPPH）：美国 Sigma公司；三氯化铁、铁氰化钾、十二烷基硫酸钠（分析纯）：西陇化工股份有限公司；没食子酸对照品（纯度均≥98%）：成都曼斯特生物制品公司。

1.2 仪器与设备

Agilent Cary 8453 UV-Vis二极管阵列分光光度计：美国Agilent公司；电子-分析天平FA1004B：上海越平科学仪器有限公司；WKH-1.7-A型热风循环烘箱：青州市精诚医药装备制造有限公司；RH-800型高速多功能粉碎机：浙江荣浩工贸有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 供试液的制备

精密称取红蓝草药材粉末适量，放入规定纯度的乙醇一定体积，在适宜温度下回流一段时间后得到提取液，过滤，稀释后即得到所需供试液。

1.3.2 红蓝草总酚酸的测定

没食子酸标准曲线的绘制：精密称取干燥好的没食子酸对照品适量，配制成0.20 mg/mL浓度的溶液，备用。

分别精密吸取适量没食子酸对照品放置于25 mL容量瓶中，加无水乙醇定容至5 mL，摇匀后暗处放置10 min，然后加入现配制2 mL的0.3%十二烷基硫酸钠溶液和1 mL的0.5%铁氰化钾-1%三氯化铁（体积比1∶1）的混合液，摇匀后暗处放置20 min，再用0.10 mol/L盐酸溶液定容至刻度，摇匀后在暗处放置30 min，以显色剂为空白溶液，在最大波长处测定吸光度值。绘制标准曲线，得到回归方程为A=52.55C+0.129 9，R2=0.999 8，总酚酸与没食子酸计，在0.004 896 mg/mL～0.014 688 mg/mL线性关系良好。

1.3.3 单因素试验考察

称取适量药材粉末，固定回流温度为70℃、回流时间为90 min、乙醇浓度为70%，按顺序加入液料比为 15 ∶1、20 ∶1、25 ∶1、30 ∶1、35 ∶1、40 ∶1（mL/g）的条件下提取红蓝草总酚酸，测定总酚酸得率，选择适宜液料比。确定最优的液料比后依次改换其余单因素，提取溶媒乙醇浓度分别为30%、40%、50%、60%、70%、80%，回流提取温度分别为 40、50、60、70、80、90℃，回流提取时间分别为 30、60、90、120、150、180min。确定前四者的最优条件，再考察提取次数1、2、3次对红蓝草总酚酸得率的影响。

1.3.4 星点试验设计-效应面法

参照文献[10-14]，根据单因素考察及星点试验的设计原理，在单因素试验的基础上，以红蓝草总酚酸得率为响应值，进行Box-Behnken Design响应面法试验，优选红蓝草总酚酸的最优工艺条件。响应面试验的因素与水平见表1。

表1 响应面试验的因素与水平Table 1 The response surface experiment factors and levels

1.3.5 红蓝草总酚酸抗氧化活性研究

根据最佳提取工艺条件及参考文献方法，进行抗氧化活性评价。参照文献的试验操作[15]，精密称取红蓝草药材粉末适量，在最优工艺条件下提取红蓝草总酚酸，参照文献[16-17]进行浓缩，减压干燥得到干浸膏，称取浸膏配制供试品溶液，依次稀释成0.125、0.25、0.5、1.0、2.0 mg/mL的系列溶液，同时配制DPPH乙醇溶液0.3 mmol/L，备用。

1.3.5.1 红蓝草总酚酸清除DPPH自由基活性测定

参照文献[16]，分别量取上述不同浓度提取物供试品溶液2.0 mL移置于试管中，并依次加入DPPH溶液6.0 mL，并避光反应30 min后于525 nm处测定吸光度，记为A1；取水2.0 mL置于10.0 mL试管中，作为空白管，其余操作同样品管，测定吸光度，记为A2；另分别量取不同浓度提取物供试品溶液2.0 mL，加入60%乙醇6.0 mL，作为对照管，反应30 min后于525 nm处测定吸光度，记为A3。采用Vc作为对照同法操作，测定吸光度记为A。以上各组重复3次，取其平均值，按下式计算其清除率。

清除率/%=[1-（A1-A3）/A2]×100

1.3.5.2 红蓝草总酚酸还原能力的测定

参照文献[18-19]，分别量取上述不同浓度提取物供试品溶液2.0 mL移置于试管中，然后按照王雨等[19]测定野桂花蜜的总酚酸的还原能力的方法，依次配好溶液，混匀。在700 nm波长处测定其吸光度，以蒸馏水做空白，采用Vc作为对照同法操作，测定吸光度。以上各组重复3次，取其平均值。

1.3.5.3 红蓝草总酚酸清除羟自由基（·OH）活性测定

参照文献[20]，分别取依次编号的具塞比色管，加入0.1 mL的磷酸盐缓冲溶液（pH 7.4）和0.4 mL的5 mmol/L的邻二氮菲溶液，然后加入0.12 mL的7.5 mmol/L的硫酸亚铁溶液，充分摇匀。再分别量取上述不同浓度提取物供试品溶液2.0 mL和0.4 mL的6 mmol/L双氧水溶液，振荡后接着加入0.2 mL的1%双氧水溶液，然后定容至10.0 mL，在37℃的水浴锅中静置30 min，在532 nm波长处测定吸光度，空白组为蒸馏水，采用Vc作为对照同法操作，测定吸光度。以上各组重复3次，取其平均值。

按下式计算其清除率。

羟自由基清除率/%=（A1-A2）/（A3-A2）×100

式中：A1为样品溶液+双氧水溶液的吸光度；A2为蒸馏水对照+双氧水溶液的吸光度；A3为用蒸馏水代替样品+双氧水溶液空白组的吸光度。

1.3.5.4 红蓝草总酚酸清除超氧阴离子自由基（·O2-）活性测定

参照文献[19-21]，分别取依次编号的具塞比色管，加入4.5 mL的50 mmol/L的Tris-HCl缓冲液（pH 8.2），放置于25℃水浴锅中20 min，再分别量取上述不同浓度提取物供试品溶液2.0 mL，然后按照王雨等[19]测定野桂花蜜的总酚酸清除超氧阴离子自由基（·O2-）活性测定的方法，依次配好溶液，混匀，在325 nm处测定吸光度，空白组为蒸馏水，采用VC对照品作为阳性对照。以上各组重复3次，取其平均值。

按下式计算其清除率。

超氧阴离子自由基清除率/%=（A0-A1）/A1×100

式中：A0为空白组的吸光度；A1为样品溶液的吸光度。

1.4 数据处理

使用Origin 9.0作图；采用Design-Expert8.0.6软件中的Box-Behnken法设计优化试验方案并对所得数据进行处理，获取回归模型及最佳提取工艺参数。

2 结果与分析

2.1 红蓝草总酚酸提取的单因素试验

2.1.1 液料比对红蓝草总酚酸得率的影响

液料比对红蓝草总酚酸得率的影响见图1。

图1 液料比对得率的影响Fig.1 Effect of liquid-solid radio on on total phenolic acids extraction rate

由图1可知，液料比对红蓝草总酚酸提取的效果呈上升趋势，在液料比为30∶1（mL/g）时，红蓝草总酚酸的得率最高，然后慢慢降低，则应该选择30∶1（mL/g）的液料比进行提取。

2.1.2 乙醇浓度对红蓝草总酚酸得率的影响

乙醇浓度对红蓝草总酚酸得率的影响见图2。

图2 乙醇浓度对得率的影响Fig.2 Effect of ethanol concentration on total phenolic acids extraction rate

由图2可知，乙醇浓度对红蓝草酚酸提取的效果呈上升趋势，在乙醇浓度为70%时，红蓝草总酚酸的得率达到最高，然后慢慢下降，则应该选择70%的乙醇浓度进行提取。

2.1.3 提取温度对红蓝草总酚酸得率的影响

提取温度对红蓝草总酚酸得率的影响见图3。

图3 提取温度对得率的影响Fig.3 Effect of extraction temperature on total phenolic acids extraction rate

由图3可知，提取温度对红蓝草总酚酸提取的效果呈上升趋势，在温度70℃时，红蓝草总酚酸的百分含量最高，然后慢慢下降，则应该选择温度为70℃进行提取。

2.1.4 提取时间对红蓝草总酚酸得率的影响

提取时间对红蓝草总酚酸得率的影响见图4。

图4 提取时间对得率的影响Fig.4 Effect of extraction time on total phenolic acids extraction rate

由图4可见，时间因素对总酚酸的提取效果在90 min以前呈上升状态，在90 min时，总酚酸的百分含量达到最高，然后慢慢下降，则应该选择时间为90 min进行提取。

2.1.5 提取次数对红蓝草总酚酸得率的影响

提取次数对红蓝草总酚酸得率的影响见图5。

从图5可以看出，在确定前面的条件下，提取次数对总酚酸得率未有显著差异，提取次数越多，得率越高，但提取液的体积越大，影响到后续的浓缩工艺，故此次选择提取次数为1次。

2.2 红蓝草总酚酸提取工艺的响应面优化分析

2.2.1 回归方程的建立与分析

图5 提取次数对得率的影响Fig.5 Effect of extraction times on total phenolic acids of extraction rate

根据单因素试验结果，以提取溶媒液料比、乙醇浓度、提取温度、提取时间为响应变量，以红蓝草总酚酸的得率为响应值，根据Box-Behnken Design模型（中心复合模型）设计四因素三水平的响应面分析试验。其响应面试验设计及结果见表2，回归模型参数检验见表3。

表2 红蓝草总酚酸的提取响应面试验设计及结果（n=3）Table 2 Total phenolic acid of the PB extraction design and response surface experiment results（n=3）

采用Design expert 8.0.6软件分析，应用Quadratic模型，总酚酸得率对表2进行数据拟合得如下函数关系式。

Y=-546.933 09+2.661 96X1+11.744 43X2+2.04022X3+1.238 22X4+0.013 487X1X2-4.567 25×10-3X1X3+2.466 67×104X1X4+1.748 75×103X2X3+3.347 58×103X2X4-9.148 75×104X3X4-0.059 725X12-0.088 823X22-0.013 969X32-7.854 06×103X42

回归模型参数检验见表3。

表3 回归模型参数检验Table 3 Parameter estimate of regression model

从方程式及表3的方差分析可知，该回归模型极显著（P＜0.000 1），该模型的相关系数为 R2=0.925 6，说明响应面值的变化有92.56%来源于所选的变量，从P值及F值可以看出，影响因子的主效应大小为：X1液料比＞X2乙醇浓度＞X3提取温度＞X4提取时间。模型确定的最佳工艺为液料比为27.37∶1（mL/g），乙醇浓度为70.96%，提取温度为70.18℃，提取时间为89.93 min。

2.2.2 两因素交互作用响应面分析

根据回归方程绘制响应面图，通过观察响应面的变化情况和稀疏程度可直观地反映各因素相互作用对红蓝草总酚酸得率的影响，结果如图6所示。当响应面的坡度越陡峭呈现扁圆形或马鞍形时，则表示两因子交互作用越显著。

图6 两因素交互作用对总酚酸得率的响应面图Fig.6 Response surface diagram of interaction of two factors on polyphenol yield

2.2.3 最佳条件的确定和模型的验证

运用采用Designexpert8.0.6软件分析，应用Quadratic模型，对红蓝草总酚酸得率的二次多项模型实行优化，选出了最佳工艺参数：模型确定的最佳工艺为液料比为27.37∶1（mL/g），乙醇浓度为70.96%，提取温度为70.18℃，提取时间为89.93 min。结合生产实际，确定红蓝草总酚酸的提取条件为：液料比为28∶1（mL/g），乙醇浓度为71%，提取温度为70℃，提取时间为90 min，在该条件下经过验证得到的红蓝草含量为31.574 4 mg/g，与预测值31.860 6 mg/g接近，表明该工艺合理，该模型可靠。

2.3 红蓝草总酚酸的抗氧化活性研究

2.3.1 红蓝草总酚酸清除DPPH自由基活性的测定

红蓝草总酚酸清除DPPH自由基活性的测定见图7。

图7 对DPPH自由基的清除能力Fig.7 Total phenolic acid of the PB removal activity of DPPH free radical

由图7可知，低浓度的红蓝草总酚酸、VC溶液，其DPPH自由基的清除能力随着浓度的增加而升高，但红蓝草总酚酸的清除率较弱。

2.3.2 红蓝草总酚酸的还原能力的测定

红蓝草总酚酸的还原能力的测定见图8。

图8 不同浓度提取液的还原能力Fig.8 Total phenolic acid of the PB reduction ability at different concentrations

由图8可知，红蓝草总酚酸和VC的还原能力随着浓度的升高，其吸光度值也逐渐升高，还原能力也逐渐增强，但红蓝草的还原能力变化不大，VC的还原能力比红蓝草强。

2.3.3 红蓝草总酚酸清除羟基自由基（·OH）的能力测定

图9 对羟自由基的清除能力Fig.9 The removal of total phenolic acid of the PB hydroxyl free radical ability

红蓝草总酚酸清除羟基自由基（·OH）的能力测定见图9。由图9可知，红蓝草总酚酸和VC清除羟基自由基的能力随浓度的升高而逐渐增强，变化比较明显，但VC的羟基自由基清除率始终高于红蓝草的羟基自由基清除率。

2.3.4 红蓝草总酚酸清除超氧阴离子自由基能力的测定

红蓝草总酚酸的清除超氧阴离子自由基能力测定见图10。

图10 对超氧阴离子的清除能力Fig.10 Total phenolic acid of the PB removal ability on superoxide anion

由图10可知，红蓝草和VC清除超氧基自由基的能力随浓度的升高而逐渐增强，变化比较明显，红蓝草和VC的超氧基自由基清除率相差较大，VC的超氧基自由基清除率始终高于红蓝草的超氧基自由基清除率。

3 结论

近年来文献对红蓝草色素稳定性的研究较多，对该物质的其他化学成分研究较少，研究欠缺系统性和深入性。本试验中对红蓝草中总酚酸进行研究，这对红蓝草的资源开发提供了理论依据。本文通过单因素试验的考察，采用星点设计-响应面试验优化红蓝草总酚酸提取工艺，即液料比为28∶1（mL/g），乙醇浓度为71%，提取温度为70℃，提取时间为90 min，在该条件下红蓝草总酚酸含量为31.574 4 mg/g，与预测值31.860 6 mg/g接近，表明该方法可行，在此条件下可用于红蓝草总酚酸的提取。采用体外抗氧化活性评价方法对红蓝草总酚酸提取液研究，发现其随着浓度增加，其清除能力逐渐增强，可作为自由基清除剂和天然抗氧化剂，具有一定的应用价值。