ANXA7和HE4在子宫内膜癌中表达的实验研究

常力川，史殿志，姜东

(1.锦州医科大学基础医学院解剖学教研室，辽宁 锦州 121000；2.辽宁省健康产业集团抚矿总医院检验科，辽宁 抚顺 113008)

子宫内膜癌是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一，其死亡率仅次于卵巢癌[1-2]。对于晚期转移或复发性子宫内膜癌患者，目前的治疗方案有限。

膜联蛋白A7是膜联蛋白超家族的成员之一[3]。ANXA7与肿瘤的发生发展密切相关，在恶性肿瘤的血管生成，增殖，凋亡，粘附，侵袭和迁移中起着重要作用[4]。人附睾蛋白4是通过基因组和蛋白质组筛选鉴定的卵巢癌肿瘤标志物。研究表明，HE4的过度表达不仅存在于卵巢癌患者中，也存在于肺腺癌，乳腺癌，胰腺癌等患者中[5]。ANXA7和HE4的表达同时上调，促进了卵巢癌的恶性行为[6-7]。血清HE4可作为子宫内膜癌患者的预后指标和术前风险评估指标[8]。然而，目前为止，尚没有研究同时测试ANXA7和HE4在子宫内膜癌中的表达。本研究，我们通过免疫组织化学方法同时比较了ANXA7和HE4在子宫内膜组织中的表达水平，分析了两种分子的相关性，并研究它们对子宫内膜癌发展的影响及其相互作用。

1 实验材料与方法

1.1 标本的收集

本研究人群由132名患者组成，于 2013年至2018年期间从本院妇产科收集标本。石蜡固定的病理标本由专家进行组织病理学确诊：子宫内膜癌，n=84；子宫内膜不典型增生(轻度增生，n=8；中度增生，n=9；严重增生，n=13)，n=30；和子宫内膜(分泌期，n=9，增殖期，n=9，见表1)。从患有不良生育能力的患者收集正常的子宫内膜标本。

1.2 细胞与试剂

子宫内膜癌细胞系(HEC-1A和Ishikawa)和卵巢癌细胞系(CaoV-3)购自上海细胞培养中心；山羊抗HE4多克隆抗体和小鼠抗人ANXA7单克隆抗体购自艾博抗(上海)贸易有限公司。

1.3 免疫组织化学和免疫细胞化学染色检测HE4和ANXA7的表达

使用5 μm连续切片切割子宫内膜组织样本，进行免疫组织化学染色。通过免疫组化链霉抗生物素蛋白过氧化物酶染色分析，HE4和ANXA7在卵巢癌组织中的表达模式。常规使用阳性和阴性免疫组织化学对照。将阴性对照与兔IgG一起孵育，代替一抗。HE4和ANXA7的一抗的工作浓度分别为1∶1000(山羊抗HE4多克隆抗体)和1∶1200(小鼠抗人ANXA7单克隆抗体)。取生长指数期的细胞，消化培养。当以单层生长30%～40%汇合的贴壁细胞时，PBS洗涤2次，4%多聚甲醛固定30 min。其余步骤与免疫组化相同。细胞膜和细胞质中表达棕黄色颗粒，认定为阳性结果。根据色素浓度强度，没有色素沉着、浅黄色、棕黄色、棕色和棕褐色分别评分为0～4。从每个切片中选择5个视野，进行评分并取出色素细胞的平均百分比：占不到5%的色素细胞为0；5%到25%为1；26%到50%为2；51%至75%为3；大于75%为4。乘以这两个数字，0到2被标记为(-)；3至4标记为(+)；5至8标记为(++)；和9到12标记为(+++)。

1.4 免疫共沉淀和Western Blot

将RIPA缓冲液(1 mL)加入子宫内膜癌细胞和卵巢癌细胞中，然后在4 ℃下温育30 min。在4 ℃以15 000 g离心30 min后，收集上清液并用2 μg小鼠抗ANXA7单克隆或山羊抗HE4多克隆抗体处理。在4 ℃下保持3 h。然后，加入20 μL蛋白质A/G PLUS-琼脂糖，然后在摇床平台上于4 ℃下温育过夜。用山羊IgG代替一抗作为阴性对照。随后对免疫沉淀物进行12%SDS凝胶电泳，并使用HE4单克隆和ANXA7单克隆抗体，通过蛋白质印迹进行分析。使用ECL试剂使蛋白质可视化。实验重复3次。

1.5 双标记免疫荧光法

选择在免疫组织化学中显示ANXA7和HE4阳性表达的子宫内膜组织切片，子宫内膜癌细胞系HEC-1A和Ishikawa进行双标记免疫荧光法。切片和细胞同时用针对HE4(1∶50)和ANXA7(1∶50)的一抗进行培养。用阴性对照的兔IgG代替一抗。异硫氰酸荧光素(FITC)和异硫氰酸四乙酯(TRITC)的工作浓度为1∶50。细胞核用4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)复染。

1.6 统计学方法

使用SPSS 17.0软件系统进行数据分析。实验数据等级资料采用秩和检验对数据进行统计学分析。Spearman相关分析用于分析两种蛋白质之间的相关性。P<0.05认为具有统计学意义。

2 结 果

2.1 ANXA7和HE4在子宫内膜癌组织切片和细胞中的形态学表达情况

免疫细胞化学检测的结果证实了ANXA7和HE4在子宫内膜癌细胞系中均有表达(Ishikawa和HEC-1A，见图1A)。免疫荧光显示通过红色荧光标记的ANXA7和通过绿色荧光标记的HE4在子宫内膜癌细胞系(见图1B)和不同子宫内膜组织(见图2)的细胞膜和细胞质中的共表达，并且观察到重叠的橙色荧光。

A：通过免疫细胞化学检测卵巢癌细胞CaoV3(a，d)和子宫内膜癌细胞HEC-1A(b，e)，Ishikawa(c，f)中的ANXA7和HE4的表达;B：双标记免疫荧光显示HE4和ANXA7在HEC-1A(a～d)和Ishikawa(e～h)中的共定位表达。“红色”：ANXA7；“绿色”：HE4；“蓝色”：细胞核；“橙色”：ANXA7和HE4的共定位图片放大倍数为400倍(A，B)，左上角的小方框中为800倍(B)

通过恶性组织(a～d)，非典型组织(e～h)和正常组织(i～l)中的双标记免疫荧光检测ANXA7和HE4的共定位

2.2 ANXA7和HE4在子宫内膜癌组织切片和细胞中的蛋白表达情况

蛋白质印迹法结果证实ANXA7和HE4在子宫内膜癌细胞系中均有表达(Ishikawa和HEC-1A，见图3A)。免疫共沉淀测试检测到两种细胞系中ANXA7和HE4之间的相互作用，见图3B和3C。

A：Western印迹检测卵巢癌和子宫内膜癌细胞系(CaoV3，HEC-1A，Ishikawa)中ANXA7和HE4的表达；B和C：免疫共沉淀检测抗ANXA7抗体(B)和抗HE4抗体(C)在CaoV3和Ishikawa和HEC-1A细胞系中的表达

2.3 ANXA7和HE4在不同子宫内膜组织中的表达

ANXA7和HE4着色主要发生在细胞膜中，在细胞质中也可观察到，见图4。ANXA7在子宫内膜癌，不典型增生和正常子宫内膜组织中的阳性表达率分别为95.2%(80/84)，83.3%(25/30)和55.6%(10/18)。实验数据采用秩和检验分析结果为恶性和非典型增生组织中的阳性表达率显著高于正常组织中的阳性表达率(两者P<0.05)；ANXA7在中、重度不典型增生组中的阳性表达率分别为88.9%(8/9)和84.6%(11/13)，均高于轻度组(75.0%[6/8]，两者P> 0.05)；分泌期子宫内膜阳性表达率为66.7%(6/9)，高于增殖期子宫内膜(44.4%[4/9]，P> 0.05)，见表1。

子宫内膜癌组HE4阳性表达率为85.7%(72/84)，明显高于非典型增生组66.7%(20/30)，正常对照组为16.7%(3/18，两者P<0.05)；HE4在不典型增生中的阳性表达率也显著高于正常对照组(P<0.05)；中、重度不典型增生组HE4阳性表达率分别为77.8%(7/9)和76.9%(10/13)，均高于轻度不典型增生组(37.5%[3/8]，两者P>0.05)；分泌期内膜中阳性表达率为22.2%(2/9)，略高于增生期子宫内膜(11.1%[1/9]，P>0.05)，见表1。

恶性组织(a，d)，非典型组织(b，e)，正常组织(c，f)中ANXA7和HE4的免疫组织化学染色照片；图片放大倍率为200倍，左上角的小方框中放大2倍

表1 ANXA7和HE4在不同子宫内膜组织中的表达

2.4 ANXA7和HE4表达的相关性

在ANXA7-/HE4-、ANXA7-/HE4+、ANXA7+/HE4-和ANXA7+/HE4+组中分别有2例、2例、10例和70例患者。相关分析显示，ANXA7和HE4在子宫内膜癌中的表达呈正相关(Spearman相关系数r=0.228，P=0.037)，见表2。

表2 子宫内膜癌中ANXA7和HE4表达之间的相关性

3 讨 论

ANXA7是钙依赖性磷脂结合蛋白，广泛存在于肿瘤细胞、内皮细胞、巨噬细胞和单核细胞的细胞膜。ANXA7参与膜转运和一系列膜表面钙调蛋白依赖的生物功能活动，包括细胞迁移、炎症反应、纤维蛋白溶解、胞吐作用、内吞作用、信号转导、细胞增殖、分化和凋亡等[9]。ANXA7在生物活性和肿瘤进展中起重要作用[10-11]。HE4因其在卵巢癌中的高度特异性表达而受到关注。通过质谱分析、免疫共沉淀和免疫荧光，证实了这两种蛋白质在卵巢癌细胞中的相互作用，以及发现ANXA7和HE4的组合激活MAPK和FOCAL信号通路，促进卵巢癌细胞的侵袭和迁移[12]。

本研究采用免疫印迹和免疫细胞化学方法检测ANXA7和HE4在子宫内膜癌细胞中的表达，并通过免疫共沉淀和双标记免疫荧光证实，其在子宫内膜癌细胞中的相互作用。我们进一步检测了ANXA7和HE4的表达水平，并显示ANXA7在子宫内膜癌和非典型增生中的表达水平显著高于正常子宫内膜。因此，ANXA7与HE4相互作用以促进子宫内膜癌的肿瘤侵袭和转移。

本研究首次检测ANXA7和HE4在不同子宫内膜组织中的表达与子宫内膜癌临床病理参数之间的关系，并分析ANXA7与HE4表达之间的相关性，提示ANXA7和HE4可能在其中起重要作用。此外，目前的研究发现，除了卵巢癌，ANXA7和HE4也在子宫内膜癌中相互作用，并共定位于细胞膜和细胞质中。