抗纤益心方对扩张型心肌病大鼠Smad3 及其相关miRNAs 的影响

杨 曦，熊 剑，魏云杰

（湖北省十堰市太和医院·湖北医药学院附属医院心血管内科，湖北 十堰 442000）

扩张型心肌病（DCM）指以心室心腔扩大和收缩功能障碍为特征的复合型心肌病，会引起心力衰竭（简称心衰）、心律失常和猝死［1］。该病的发病群体以50 岁以上中年人居多，起病缓慢，早期诊出率较低［1］，且病因不明，致死率较高，无特效治疗手段，预后极差［2］。中医根据DCM 的症状及病理特点，将其归于“心衰病”“水肿”“心水”等范畴，病机在于心之阳气不足，无力推动血行，瘀血积聚，或水饮不化，痰湿停留，继而使心体胀大［3］，因此益气、活血、利水为治疗该病的基本原则。西医常规治疗以对症治疗、控制心律失常和心衰、纠正心室重构为主，但其远期疗效有限；中医可明显缓解其临床症状，毒副作用较西药少，在改善心肌异常、逆转心肌纤维化，降低病死率，提高生活质量，改善预后方面均有明显优势［3-4］。抗纤益心方具有益气升陷、活血化瘀功效，能改善临床症状，减小左室舒张末内径、左房内径，改善心功能［5-6］。王振涛等［7］的研究结果显示，抗纤益心方可下调DCM 模型大鼠基质金属蛋白酶-1（MMP-1）和上调基质金属蛋白酶-1 抑制剂（TIMP-1）蛋白水平，减轻心肌组织纤维化，抑制心室重构。张会超等［8］也观察到抗纤益心方对DCM 大鼠心肌纤维化有一定的抑制作用，并能改善心功能，其作用机制与转化生长因子β（TGF-β）/Smads 信号系统密切相关。微小RNA（miRNAs 或miRs）是一系列长约22 nt 的非编码RNA，能通过海绵作用吸附其靶向mRNA，调控了有机体超过70%的基因活动，是近几年病理机制研究的热点，为诸多疾病的临床诊治提供了新靶点和新方向。心肌纤维化增生导致的心室重构是扩张型心肌病发生与发展的中心环节［9］。本研究中选取Smad3，对可能调控其mRNA表达的miR-23-3p 和miR-145-5p 进行了分析，观察了抗纤益心方对各指标的影响，以及各指标间的关系，探讨抗纤益心方治疗DCM 的作用机制。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器、试药与动物

仪器：ABI 7500 型实时荧光定量聚合酶链式反应（PCR）扩增仪（美国应用生物系统公司）；Nanodrop 分光光度计（天根生化科技＜北京＞有限公司）；Mini-PROTEAN® Tetra 小垂直板电泳槽（伯乐生命医学产品＜上海＞有限公司）；Trans-Blot 小型转印槽（伯乐生命医学产品＜上海＞有限公司）；Image-Pro Plus 6.0 图像处理分析系统（美国Media Cybemetics 公司）；1-14k型台式高速冷冻离心机（德国Sigma 公司）；Vevo 770TM型小动物彩色多普勒超声仪［加拿大VisualSonics Inc.公司，电压为（220±22）V，频率为（50±1）Hz，主机采集频率≥1 000 Hz，大鼠实验探头频率为15～22 MHz］。

试药：抗纤益心方为干浸膏，由党参、黄芪、云苓、白术、丹参、川芎、红花、赤芍、泽兰和益母草组方，由医院制剂室提供，每1 g 浸膏相当于生药4 g；呋喃唑酮片（山西云鹏制药有限公司，批号为I-14023937）；卡托普利片（常州制药厂有限公司，批号为I-B2023731）；戊巴比妥钠（中国医药＜集团＞上海化学试剂公司，批号为F20021216）；Smad3 多克隆抗体和辣根过氧化物酶标记的二抗（中国Abcam 官网，批号分别为GR160516-2，GR160311-1）；miR-23-3p、miR-145-5p 扩增引物（生工生物工程＜上海＞股份有限公司，批号分别为20160211，20160218）；实时荧光定量PCR 试剂盒（上海罗氏公司，批号为75117）；TGF-β、MMP-1 及TIMP-1 酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒（生工生物工程＜上海＞股份有限公司，批号分别为D730443，D730566，D730582）。

动物：健康清洁级Wistar 大鼠90 只，雌雄各半，6～8 月龄，体质量（220±20）g，购自山东鲁抗动物中心［合格证号为SCXK（鲁）2016-0003］。所有大鼠常规饲养，自由进食进水，温度22～25 ℃，相对湿度40%～60%。本研究经湖北医药学院动物伦理委员会审批，动物饲养、干预及处死等操作均遵循有关实验动物管理和使用规定。

1.2 试验方法

动物分组与模型制备：所有大鼠适应性饲养1 周后称定体质量，根据体质量进行随机区组化分组，分为对照组（A 组）、模型组（B 组）、卡托普利组（C 组）、抗纤益心方低剂量组（D 组）、抗纤益心方中剂量组（E 组）和抗纤益心方高剂量组（F 组），各15 只。A 组正常饲养；其余5 组均参照文献［10］的方法制备DCM 大鼠模型，将存活大鼠行超声心动图检查，与A 组大鼠比较，左心室腔扩大，室壁变薄，左心室射血分数低于40%为造模成功［7］。造模成功后予以药物干预，根据LD50实验［11］确定动物的有效给药剂量，以此设置抗纤益心方高、中、低3个剂量。C 组大鼠每日灌胃卡托普利10.125 mg/kg；D组、E 组、F 组大鼠每日分别灌胃抗纤益心方4.7，9.4，18.8 mg/kg；A 组与B 组大鼠予等量无菌蒸馏水灌胃刺激。共灌胃8 周，给药期间，B 组有2 只大鼠死亡，D 组有1 只死亡，其余大鼠均进行后续实验，并纳入最终的试验结果中，最终A 组、B 组、C 组、D 组、E 组和F 组的大鼠样本量分别为15，13，15，14，15，15 只。

超声心动图测定心功能：各组大鼠最后1 次给药24 h 后，给予50 mg/kg 1%戊巴比妥钠麻醉，采用超声心动图检测大鼠心功能指标：左室收缩末压（LVESP）、左室舒张末压（LVEDP）及左心室内压最大上升/下降速率（±dp/dtmax）。

蛋白质印迹（WB）法检测心肌Smad3 蛋白表达：将大鼠麻醉后，先开腹，取腹腔主动脉血2 mL，用于荧光定量PCR 试验，再开胸腔取心脏，吸干水分，并称定质量。从心尖位置沿冠状面切取心肌组织2 份，-80 ℃存储。取待测心肌100 mg，置2 mL 离心管中，剪碎，加入400 μL 裂解液（RIPA ∶PMSF=100 ∶1），电动匀浆器匀浆，充分裂解后离心，12 000 r/min 离心5 min，将上清液转移至新的EP 管中，-20 ℃存储，当天使用。首先，采用BCA 试剂盒测定蛋白浓度，应用buffer 缓冲液配置质量浓度为1.0 μg/μL 的混悬液，以备SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。使用5 %浓缩胶和10 %分离胶进行蛋白电泳；上样前先将蛋白质样本煮沸10 min 使其变性，上样时调整上样量，保证一致；先80 V 电泳30 min，再120 V 至电泳完成；80 V 恒压转膜1 h；室温条件用5%脱脂奶粉封闭2 h；加入用Tween-20 Tris 盐酸稀释的Smad3 多克隆抗体（1 ∶1 000）4 ℃孵育过夜，TBST 液清洗3 次，每次10 min；加入辣根过氧化物酶标记的二抗（1 ∶1 000）室温孵育2 h，TBST 液清洗3 次，每次10 min；ECL 显色液A 液和B 液混合均匀1 min 后，将膜蛋白面与ECL 底物充分接触1 min，放入X 光片夹中；置暗室中曝光、显影、定影。显影后扫描蛋白质印迹显影图，用ImageJ图像分析软件分析条带灰度值，以目标蛋白质条带灰度值与内参蛋白（β-actin）条带灰度值的比值（Smad3/β-actin）代表目标蛋白质的相对表达量。

双荧光素酶试验测定Smad3 和miRNAs 间的靶向性：试验细胞为大鼠心肌成纤维细胞，培养至对数生长期，接种至96 孔板，设为pmir-GLO 组、Smad3-WT组、Smad3-MUT 组，每组6 个复孔。分别将pmir-GLO质粒、Smad3-WT 质粒和Smad3-MUT 质粒转染至相应的细胞，培养6 h，更换培养基再培养48 h。将转染后的细胞进一步分为2 个亚组，分别采用miRNA mimics（miR-145-5p，miR-129-3p，miR-23-3p）及其对照NC mimics 干预，加入相应miRNA mimics 和NC mimics，更换培养基培养24 h 后行双荧光素酶报告基因实验。按双荧光素酶报告试剂盒说明书要求裂解细胞，配置发光液，先将20 μL 样品置入测量管，再加入100 μL发光液，轻轻敲击管壁，使其混匀。记录萤火虫荧光素酶的相对荧光活性。

实时荧光定量PCR 法检测miR-23-3p 及miR-145-5p 的表达水平：采用Trizol 法提取全血总RNA，用nanodrop 分光光度计检测RNA 的纯度和浓度，质量合格的样本置-80 ℃保存，用于后续试验。采用Prime-ScriptTMⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit 进行RNA 反转录，严格按试剂盒步骤操作。反转录完成后置-80 ℃保存备用。采用GoTaq® qPCR Master Mix 试剂盒和ABI 7500 型实时荧光定量PCR 扩增仪检测miR-23-3p和miR-145-5p 的表达水平。反应体系：GoTaq® qPCR Master Mix 25 μL，upstream primer 1.0 μL，downstream primer 1.0 μL，模板cDNA 1.0 μL。反应条件：95 ℃1 min，95 ℃30 s，60 ℃30 s，72 ℃30 s，共扩增40 个循环；溶解曲线95 ℃15 s，60 ℃1 min，95 ℃1 s。每个样本做3 个重复，最终的Ct 值取3 个重复的平均值。选择U6 作为内参基因，miR-23-3p 和miR-145-5p 的相对表达量以公式n=2-ΔΔCt来计算。

ELISA 法检测TGF-β、MMP-1 及TIMP-1 蛋白水平：取适量心肌组织，剪碎，匀浆，严格按TGF-β，MMP-1 及TIMP-1 ELISA 试剂盒的操作说明检测心肌组织研浆液的TGF-β，MMP-1 及TIMP-1 蛋白水平。

1.3 统计学处理

采用SPSS 19.0 统计学软件分析。数据均为连续性变量，采用± s 表示，多组间比较采用单因素方差分析；如有统计学差异则采用LSD- t 检验。

2 结果

2.1 大鼠心功能指标

与A 组相比，B 组大鼠的LVESP 和±dP/dtmax明显下降，LVEDP 明显上升，差异有统计学意义（P＜0.05）。与B 组相比，C 组、D 组、E 组、F 组大鼠的LVESP 和±dP/dtmax显著升高，LVEDP 显著下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。与D 组相比，E 组和F 组大鼠的LVESP和±dP/dtmax显著升高，LVEDP 显著下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。详见表1。

表1 各组大鼠心功能指标比较（ ± s）

表1 各组大鼠心功能指标比较（ ± s）

注：与A 组相比，*P ＜0.05；与B 组相比，△P ＜0.05；与D 组相比，#P ＜0.05。

组别A 组（n=15）B 组（n=13）C 组（n=15）D 组（n=14）E 组（n=15）F 组（n=15）LVESP 135.2±11.3 75.9±10.1*116.9±10.4△97.4±9.6△129.2±9.3△#130.8±8.9△#LVEDP 5.6±1.3 10.9±1.8*6.5±1.4△8.3±1.9△5.2±1.7△#5.4±1.5△#+dp/dtmax 3 897±699 3 021±330*3 469±219△3 199±411△3 701±503△#3 821±415△#-dp/dtmax 3 753±272 3 029±243*3 489±236△3 099±254△3 600±259△#3 697±356△#

2.2 对DCM 大鼠Smad3 表达水平的影响

与A 组相比，B 组大鼠的心肌Smad3 蛋白表达明显升高；与B 组相比，C 组、D 组、E 组、F 组大鼠的心肌Smad3 蛋白表达水平显著降低；与D 组相比，E 组和F 组大鼠的心肌Smad3 蛋白表达水平降低，且F 组低于E 组，差异有统计学意义（P＜0.05）。详见图1。

图1 各组扩张型心肌病大鼠Smad3 表达水平

2.3 Smad3 相关miRNAs 的验证

生物信息学分析结果显示，在与Smad3 基因存在结合位点的鼠源miRNAs 中，miR-145-5p，miR-129-3p，miR-23-3p 有较高的研究价值。采用双荧光素酶报告试验检测了以上3 种miRNAs 与Smad3的结合能力。结果见图2。可见，miR-145-5p 与Smad3，miR-129-3p 与Smad3 均有较高的靶向结合能力。

图2 Smad3 基因相关的miRNAs 生物信息学及双荧光素酶分析结果

2.4 对DCM 大鼠miR-23-3p 和miR-145-5p表达水平的影响

与A 组相比，B 组大鼠的循环miR-23-3p 和miR-145-5p 表达水平明显降低（P＜0.05）；与B 组相比，C 组、D 组、E 组、F 组大鼠的循环miR-23-3p和miR-145-5p 表达水平明显增高，差异有统计学意义（P＜0.05）。与D 组相比，E 组和F 组大鼠的循环miR-23-3p 和miR-145-5p 表达升高，且F 组高于E 组，差异有统计学意义（P＜0.05）。详见表2。

表2 6 组扩张型心肌病大鼠miR-23-3p 和miR-145-5p表达水平比较（ ± s）

表2 6 组扩张型心肌病大鼠miR-23-3p 和miR-145-5p表达水平比较（ ± s）

注：与A 组相比，*P ＜0.05；与B 组相比，△P ＜0.05；与D组相比，#P ＜0.05；与E 组比较，□P ＜0.05。下表同。

组别A 组（n=15）B 组（n=13）C 组（n=15）D 组（n=14）E 组（n=15）F 组（n=15）miR-23-3p 4.235 ±0.161 2.789 ±0.187*4.089 ±0.192△3.358 ±0.137△4.007 ±0.155△#4.169 ±0.163△#□miR-145-5p 4.282 ±0.104 2.309 ±0.175*4.197 ±0.140△3.324 ±0.131△4.173 ±0.128△#4.201 ±0.143△#□

2.5 心肌组织Smad3 表达与循环miR-23-3p 和miR-145-5p 水平的相关性

Pearson 检验结果显示，大鼠心肌组织Smad3 表达与循环miR-145-5p 水平呈负相关性（R=-0.848，P＜0.05）；与循环miR-23-3p 水平也呈负相关性（R=-0.813，P＜0.05），其相关直线见图3。

图3 心肌组织Smad3 表达与循环miR-145-5p，miR-23-3p水平的相关直线

2.6 对DCM 大鼠TGF-β，MMP-1 及TIMP-1 水平的影响

与A 组相比，B 组大鼠的TGF-β 和MMP-1 表达水平明显升高（P＜0.05），TIMP-1 的表达水平明显降低；与B 组相比，C 组、E 组、E 组、F 组大鼠的TGF-β和MMP-1 表达水平明显降低，TIMP-1 表达水平明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。与D 组相比，E 组和F 组大鼠的TGF-β 和MMP-1 水平降低，且F 组低于E 组；E 组和F 组大鼠的TIMP-1 水平升高，且F 组高于E 组，差异有统计学意义（P＜0.05）。详见表3。

表3 6 组扩张型心肌病大鼠TGF-β，MMP-1 及TIMP-1 水平比较（ ± s）

表3 6 组扩张型心肌病大鼠TGF-β，MMP-1 及TIMP-1 水平比较（ ± s）

组别A 组（n=15）B 组（n=13）C 组（n=15）D 组（n=14）E 组（n=15）F 组（n=15）TGF-β（μg/g）46.2±3.7 68.3±7.9*49.2±5.4△59.5±6.5△52.3±5.8△#47.2±5.2△#□MMP-1（ng/g）244.2±32.1 455.2±41.3*293.8±35.1△370.2±40.4△300.1±27.4△#275.6±21.7△#□TIMP-1（ng/g）696.2±75.2 463.7±55.5*655.3±58.3△477.8±51.9△544.7±60.8△#602.8±60.6△#□

3 讨论

中医认为，DCM 多因先天不足，或因后天失养，导致心气虚，调治不当，发展为心阳虚、心之气阴两虚，形成瘀血、痰湿、水饮等病理产物，病位在心，与肺、肝、脾、肾密切相关［3，12］。王晓景等［13］的研究结果显示，DCM 为本虚标实、虚实夹杂之症，本虚以阳虚、气虚为主，标实以血瘀、水停为主。DCM 心气虚是基础，心气亏虚，鼓动无力，血脉不畅必致血瘀，血瘀是中心环节，气虚血瘀存在于病变发展过程中的各个环节，故采用抗纤益心方治疗该病疗效可靠［5-8］。

心室重构是扩张型心肌病发生与发展的中心环节，心肌组织纤维化增生是参与心室重构的关键［14］。抗纤益心方对改善DCM 的临床症状和心室形态有积极作用，但其药理机制尚不明确。TGF-β1信号是参与纤维化增生的主要信号之一，在各种原因导致的心室重构中均介导重要机制［15］。Smads 家族蛋白是将TGF-β1信号从胞膜和胞质传递至胞核的重要转运蛋白，TGF-β 的直接作用底物，为TGF-β 信号通路中的关键传导分子［16］。目前，已知的Smads 家族蛋白主要为Smad1～Smad9，其中参与TGF-β1信号转导的主要为Smad2 和Smad3，由于Smad3 是介导心肌纤维化增生和心室重构的关键物质，故选择Smad3［17］。TGF-β1/Smad3 信号通路在多种原因导致的心室重构中起介导作用，体外细胞学试验证实，其作用机制可能与诱导纤维细胞向肌成纤维细胞转化，增强胶原蛋白的分泌等有关［18］。机体在正常状态下，对心室重构起决定作用的心肌细胞外基质处于产生和降解的动态平衡，MMPs 是体内参与心肌细胞外基质降解的最主要酶系，TIMP-1 是MMP-1 的特异性抑制剂，故两者间的平衡对维持心脏正常的代谢具有重要意义［19］。TGF-β 是一种心肌细胞外基质的有效调节因子，能促进胶原的合成，并调节多种编码MMP 的基因表达。研究显示，抗纤益心方能抑制DCM 大鼠TGF-β1的表达，这可能是抗纤益心方干预DCM 大鼠动物模型心室重构的机制之一［8，20］。本研究结果显示，抗纤益心方DCM 大鼠心肌组织中Smad3 的表达有抑制作用，也就抑制了TGF-β / Smad3 信号通路的激活，减轻心肌组织的纤维化，因此对于改善其心肌功能有明显效果。

本研究中在分析Smad3 与miRNAs 相关性前，首先采用生物信息学分析和双荧光素酶试验验证了Smad3与各个miRNAs 的结合能力，从中筛选了miR-23-3p和miR-145-5p 这2 项指标。SUN 等［21］的研究已证实，miRNAs 主要通过与靶向mRNA 的非编码区、开放阅读框、启动子或RNA 结合蛋白结合，从而导致靶向mRNA 降解或翻译抑制。有研究显示，miR-23-3p 和miR-145-5p 对Smad3 的表达有负调控作用，当miR-23-3p 和miR-145-5p 的表达水平较高时，Smad3 的表达水平降低［22］。本研究结果显示，DCM 大鼠的Smad3 表达水平升高，miR-23-3p 和miR-145-5p表达水平降低，其变化趋势相反，Pearson 检验也证实Smad3 和miR-23-3p、Smad3 和miR-145-5p 间呈负相关，从临床角度证实了在DCM 中各个指标存在相互作用。ELISA 结果显示，抗纤益心方能明显改善DCM大鼠的TGF-β，MMP-1，TIMP-1 蛋白表达水平，尤其是高剂量抗纤益心方基本与西药卡托普利的药效相当。本研究结果显示，应用抗纤益心方后，大鼠的循环miR-23-3p，miR-145-5p，TIMP-1 水平升高，心肌组织Smad3 和TGF-β，MMP-1 表达水平降低；另外，各指标的变化趋势受抗纤益心方剂量的影响，呈剂量依赖性，其最佳剂量尚有待验证。

综上所述，抗纤益心方可上调DCM 大鼠的miR-23-3p 和miR-145-5p 的表达，下调Smad3 的表达，进而影响TGF-β/Smad3 通路，从而改善DCM 大鼠的心功能，其最佳有效剂量和用药时间还有待进一步研究。