5种野生堇菜属植物种子生物学特性研究

蔡 慧，丁彦芬*，董丽娜，杨甲乐，赵美婷

(1.南京林业大学 风景园林学院，江苏 南京 210037； 2. 中山陵园管理局，江苏 南京 210014)

野生花卉指现在仍在原产地处于天然自生状态待开发利用的观赏植物，不仅是地方天然风景和植被的重要组成部分，也是培育花卉新品种重要的种质资源和原始资料[1]。中国享有“世界园林之母”和“世界花卉宝库”的美称，野生花卉资源非常丰富[2]。据统计，全世界观赏植物约3万种，我国原产观赏植物有1～2万种，较常用的仅约2000种[3]。采用乡土野生花卉资源进行引种栽培，其抗逆性强，节省后期的维护管理，可以真正做到节约园林成本又能增加生物多样性。然而，目前对野生地被花卉的生态性研究及引种驯化方面的研究还相对较少。

堇菜属(ViolaL.)植物种质资源丰富，约500余种，广布热带、亚热带及温带，主要分布于北半球的温带地区[4]。堇菜属植物开花早、绿期长，在我国分布广、种类多、对当地环境适应性强、多数为多年生、一次种植可多年观赏[5]。同时，本属大多数种类在我国南方地区3～5月开花，花形美观，是城市园林绿化的重要草种资源，可弥补我国南方地区早春露地花卉及其应用方面的不足[6]；堇菜属植物还具有较高的药用价值，具有止痛消炎、清热解毒、抗氧化、抗免疫缺陷等药理作用[7-8]。然而目前对该属的研究较局限，在园林应用方面研究较少。堇菜属植物多数处于野生状态，因其较高的药用价值，造成过度采挖，导致野生堇菜属植物资源逐渐减少，因此亟需人工驯化栽培。堇菜属植物以种子繁殖为主，结实多，但对于堇菜属植物种子生物学特性及萌发条件缺乏系统的研究[9]。

本文以具有地域景观特色的堇菜属植物——采自南京市紫金山的早开堇菜(Violaprionantha)、犁头草(Violajaponica)、戟叶堇菜(Violabetonicifolia)、长萼堇菜(Violainconspicua)和紫花堇菜(Violagrypoceras)5种野生堇菜属植物种子为试验材料，对其生物学特性及萌发条件进行研究，通过体视显微镜及电镜对种子形态及种皮微细胞结构进行观察，测定种子千粒重、吸水性、种子生活力等指标，研究不同处理下5种野生堇菜属植物种子的萌发情况，以期为堇菜属植物遗传育种及分类提供依据，促进中国野生堇菜属植物资源的开发利用，加快其引种驯化进程，为中国野生堇菜属植物的种质资源保护、种子扩繁、园林应用等提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验种子于2019年5月采集于南京市紫金山(118°51′36" E，32°3′9" N)，放置于室内通风处，使其种子自然弹射出种皮，选择颗粒饱满种子为供试种子。

1.2 种子生物学特性测定

1.2.1 种子的形态特征及千粒重测定

利用体视显微镜分别对5种植物种子长、宽进行测量，并通过扫描电镜观察种子形态特征。采用百粒法，从每种植物的种子样品中随机取出100粒种子，用1/10000分析天平(ME204-02，梅特勒-托利多)称重，重复8次，最后换算成千粒重[10]。

1.2.2 种子吸水率的测定

各种植物的种子材料取完整、划开种皮和去除种皮的种子各30粒，置于10 mL离心管中，加蒸馏水8 mL，每种处理重复3次。放于恒温25℃条件下，每隔2 h取出用吸水纸吸干表面水分后称重，12 h后每12 h取出称重，直到重量不变为止，最后计算种子吸水率。

种子吸水率(%)=(Wt-W0)/W×100

式中，Wt为吸水一定时间后种子的重量，W0为种子初始重量。

1.2.3 种子生活力的测定

于2019年6月和2019年12月，分别测定种子生活力。使用浓度为0.2%的2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC溶液)浸泡刚采集的以及经过室温和低温(4℃)储存的5种植物的种子，每个处理 3 次重复，50 粒/重复。根据胚的染色程度和染色的深浅来鉴定种子的生活力。

种子生活力(%)=Vt/V0×100%

式中，Vt为染色或大部分染色种子数，V0为供试种子数。

1.3 种子发芽率测定

种子萌发试验于2019年6月、2019年12月进行，在培养箱(RDN-400D-4，宁波东南仪器有限公司)内萌发。供试种子成熟、饱满，未受昆虫和病菌侵害，试验前将种子统一预处理：1%次氯酸钠浸泡5 min消毒，无菌水冲洗3次后，75%酒精消毒2次，冲洗干净[11]。培养箱温度设置为25℃，湿度80%，避光处理4 d，发芽后改为光照培养(2000LX)，每天光照12 h，黑暗12 h，以3 d种子萌发数不变为发芽截止时间，每天观察记录发芽的种子数[12-13]。

1.3.1 浸种试验

2019年6月，随机选取刚采集的5种植物的种子各300粒，预处理后，分为两份，一份直接进行萌发试验，一份25℃水浸种5 h后进行试验。

1.3.2 储存条件试验

2019年12月，分别取室温和4℃冰箱储藏6个月的5种种子各150粒，预处理后，每组50粒，3次重复。

1.3.3 赤霉素处理试验

试验于2019年12月进行。供试种子为室温储存6个月的5种野生堇菜属植物种子。取籽粒饱满、经过预处理的5种种子在浓度为100、200、300、500、750 mg/L的赤霉素中浸泡种子4、8、12、24 h，分别以清水浸泡为对照。每组50粒，3次重复，置于培养箱中进行试验。发芽期间，每天统计发芽数(胚芽突破种皮长度超过种子的一半为发芽)。

1.4 数据处理

采用Excel 2003和SPSS 24.0软件对数据进行统计分析。采用单因素(one-way ANOVA)和Duncan法进行方差分析和多重比较(α=0.05)。利用Excel 2003和Origin 2017软件作图。

2 结果与分析

2.1 堇菜属植物种子生物学特性

2.1.1 种子外形及千粒重

利用体视显微镜对5种野生堇菜属植物种子分别进行拍照观察，测量其长、宽(表1)。其中早开堇菜、犁头草种子较大，两种种子颜色均为深褐色；另外三种植物种子相对较小，戟叶堇菜、长萼堇菜种子颜色均为深红棕色，紫花堇菜种子颜色为深棕色。在电镜扫描下，5种堇菜属植物种子均为网状纹饰，但网纹排列、规则度明显不同，网眼大小各异(图1)。以百粒法对5种野生堇菜属植物千粒重进行测定，结果表明犁头草种子千粒重>早开堇菜>紫花堇菜>戟叶堇菜>长萼堇菜，其中早开堇菜和犁头草差异不显著，与紫花堇菜、戟叶堇菜、长萼堇菜种子千粒重差异显著(P<0.05)。

图1 5种野生堇菜属植物种子种皮微结构

2.1.2 种子吸水率

从吸水曲线看，5种野生堇菜属植物种子的吸水率随时间增加均表现为上升趋势，2 h内为快速吸水期，2～12 h为缓慢吸水期，12 h基本达到饱和后吸水率趋于平稳(图2)。除紫花堇菜，三种处理均无显著差异外，另外4种野生堇菜属植物种子未处理及划破种皮处理的吸水率无显著差异(P<0.05)，吸水前2 h划破种皮处理的种子表现为更高的吸水率，在吸水后期完整种子的吸水率略高于破皮种子，但去除种皮处理的吸水率低于前两个处理。说明种皮对5种野生堇菜属植物种子的吸水不起限制作用，相对种皮而言种子的胚乳组织更致密，没有种皮的吸水以及持水特性。就吸水率而言，早开堇菜>犁头草>戟叶堇菜=长萼堇菜>紫花堇菜，三种处理下紫花堇菜种子吸水率均表现为最低。

图2 5种野生堇菜属植物种子吸水曲线

2.1.3 种子生活力

5种野生堇菜属植物种子属于有胚乳种子，经染色，生活力最高的胚乳部分也被染成鲜红色；次之，仅胚染为鲜红；无生活力的种子胚没有染色成功或染色面积少于1/2。根据5种野生堇菜属植物种子生活力测定结果显示，早开堇菜种子生活力最高，不仅胚染为鲜红，而且多数胚乳也染为红色；戟叶堇菜次之，少数胚乳染为红色；其次为犁头草、长萼堇菜，多为胚染色；紫花堇菜种子生活力最低，表现为染色面积小、颜色浅等现象。同种野生堇菜属植物种子经过6个月储藏后，生活力有所降低，除戟叶堇菜常温储存下生活力显著降低外，其他堇菜属植物种子在两种储存条件下种子生活力差异不显著(P<0.05)；同种处理下，犁头草、长萼堇菜种子生活力差异不显著，其他几种种子生活力差异显著(图3)。5种野生堇菜属植物在染色6 h时被染种子数最多，6 h后出现褪色。

图3 5种野生堇菜属植物种子生活力

2.2 堇菜属植物种子萌发特性

2.2.1 浸种对种子萌发的影响

结果表明，浸种处理的种子发芽率低于不做处理的种子，浸泡处理的种子发芽较早，但后期霉变严重，影响种子正常发芽。同种植物在不同处理下，早开堇菜、紫花堇菜差异不显著，犁头草、戟叶堇菜、长萼堇菜种子发芽率差异显著(P<0.05)；同种处理下，5种野生堇菜属植物种子发芽率差异显著(P<0.05)，早开堇菜>戟叶堇菜>犁头草>长萼堇菜>紫花堇菜(图4)。

图4 浸种处理对5种野生堇菜属植物种子发芽率的影响

2.2.2 储存条件对种子萌发的影响

除早开堇菜发芽率较高不受储存条件影响外，另外4种植物表现为低温储存种子发芽率高于室温储存，不同处理下，早开堇菜、紫花堇菜发芽率差异不显著，犁头草、戟叶堇菜、长萼堇菜种子发芽率差异显著(P<0.05)；室温储藏下长萼堇菜、紫花堇菜发芽率差异不显著，其余三种种子发芽率差异显著，低温储藏下，5种堇菜属植物种子发芽率差异显著(图5)。与6月份发芽试验相比，除早开堇菜外，种子发芽率随储存时间增加有所降低。

图5 不同储存条件对5种野生堇菜属植物种子发芽率的影响

2.2.3 赤霉素处理对种子萌发的影响

结果表明：除紫花堇菜外，赤霉素处理可提高其他4种堇菜属种子发芽率。

使用不同浓度GA3、不同时间浸泡处理的早开堇菜，与对照相比发芽率增加，差异显著。相同浸泡时间下，750 mg/L GA3处理下早开堇菜发芽率最高，其次为500 mg/L GA3处理，差异不显著，750 mg/L GA3处理8 h发芽率最高；经过赤霉素处理的早开堇菜6天内可完成发芽，发芽高峰期出现在第3天，且发芽率高达96%。

使用不同浓度GA3、不同时间浸泡处理的犁头草，与对照相比发芽率增加，差异显著。相同浸泡时间下，犁头草在500 mg/L GA3处理时发芽率最高，其次为300 mg/L GA3处理，种子发芽率差异显著，其中500 mg/L GA3浸泡8 h发芽率最高；经过300、500 mg/L GA3处理的犁头草15 d内可完成发芽，发芽高峰期出现在第9 d，且发芽率高达44%。

戟叶堇菜在不同GA3浓度、不同时间浸泡处理下，与对照相比发芽率增加，差异显著。相同浸泡时间下戟叶堇菜在500 mg/L GA3处理下发芽率较高，其次为750 mg/L，差异显著，其中500 mg/L GA3处理8 h发芽率最高；经过300、500、750 mg/L GA3赤霉素处理的戟叶堇菜10 d内可完成发芽，发芽高峰期出现在第6天，且发芽率高达60%。

100 mg/L GA3浸泡处理长萼堇菜种子4 h、12 h、24 h与对照相比差异不显著，其余处理与对照相比发芽率差异显著。相同浸泡时间下500 mg/L GA3处理长萼堇菜发芽率较高，其次为300 mg/L，差异显著，在500 mg/L GA3处理8 h下发芽率最高；经过300、500 mg/L GA3处理的长萼堇菜12 d内可完成发芽，发芽高峰期出现在第8 d，发芽率最高达36%(图6)。紫花堇菜经过100～750 mg/L的赤霉素处理并不能发芽，有待进一步研究。

图6 赤霉素处理对4种野生堇菜属植物种子发芽率的影响

3 讨论与结论

5种野生堇菜属植物种子均为卵圆形，基部平钝，顶端为萌发口尖突成喙状。通过扫描电镜对5种堇菜属植物种子的表皮微结构进行观察比较发现，5种植物种子均为网状纹饰，早开堇菜、犁头草、长萼堇菜纹饰排列较为整齐，网眼形状各异；戟叶堇菜、紫花堇菜呈不规则的网状纹饰，戟叶堇菜网脊突出，起伏较大，紫花堇菜网眼呈较规则的六边形。李连方等[14]对华北地区22种堇菜属植物种子进行扫描电镜观察，其中包括美丽堇菜亚属(Subgen.Melanium)、二裂花柱亚属(Subgen.Dischidium)及堇菜亚属(Subgen.Viola)，堇菜亚属种皮纹饰出现多元性分化，表现为更高的进化水平，研究结果与本文研究的5种野生堇菜亚属植物种子电镜扫描结果相同。不同种间堇菜属植物种子表面微观结构差异可作为不同种间堇菜属植物种子差异鉴定的依据之一。在直观的分类学上，种子表面微观结构特征具有重要价值[15]。

充足的水分是堇菜属植物种子萌发的必要条件之一。种子吸水使种皮软化，增强其透气性，种胚内酶活性随之增强，其代谢活动更为活跃；反之，由于种子缺水，会导致种胚因缺乏营养物质致使发芽率降低[16]。常彦莉等[17]以贝母(FritillariaL.)种子为试验材料，对其进行吸水试验，结果将种子吸水过程分为急剧吸水阶段、稳定吸水阶段和饱和吸水三个阶段。潘春柳等[18]研究发现完整绞股蓝种子和破皮绞股蓝种子吸水率相差不大，说明种子休眠不是来源于种皮障碍，非物理休眠。本研究表明，5种野生堇菜属植物种子前2 h为快速吸水期，与董慧等[19]研究结果一致；完整种子和破皮种子吸水率无显著差异；去除种皮的堇菜属植物种子因致密的胚乳以及没有种皮吸水性和持水性而表现为较低的吸水率；紫花堇菜种子吸水率明显低于其他4种植物种子，可能是由于致密的胚乳结构抑制其萌发[20]。

种子生活力测定结果表明，染色浓度为0.2%时，置于30℃培养箱中染色6 h效果最好，可以很好地检测堇菜属植物种子生活力水平，评估种子潜在发芽能力。低温储藏下不同种子生活力有不同程度的降低，除戟叶堇菜外，差异均不显著，与张玲卫等[21]研究结果一致。不同处理下，从种子生活力看，早开堇菜>戟叶堇菜>犁头草=长萼堇菜>紫花堇菜。种子生活力测定方法受染色温度、染色时间、染色浓度等多方面因素影响，对堇菜属植物种子生活力最适测定方法还需进一步研究。

对5种野生堇菜属植物种子萌发特性的研究结果表明，浸种处理的种子发芽较早，但浸种处理下种子萌发率较未处理种子低，原因可能是堇菜属植物种子吸水性强，长时间浸泡使胚得不到有效呼吸，种子失活，后期霉变严重，影响种子正常发芽，因此播种时忌雨季及浇水过量；除早开堇菜外，低温储存的种子发芽率高于常温储存处理，与刘建成等[22]以川东獐牙菜种子为试验材料，提出低温下贮藏可延长种子寿命结果一致；经过6个月储存，种子发芽率有所降低，该结果与卢军[23]、赵陆滟[24]等的研究结果一致，但几种堇菜属植物种子生活力并没有显著下降，说明堇菜植物种子较耐储存。几种堇菜属植物种子生活力均高于发芽率，其中，早开堇菜种子生活力平均值达96%，较发芽率平均值高出16%；犁头草种子生活力平均值达42%，较发芽率平均值高出33%；戟叶堇菜种子生活力平均值达64%，较发芽率平均值高出36%；长萼堇菜种子生活力平均值达41%，较发芽率平均值高出46%；紫花堇菜种子生活力平均值达12%，较发芽率平均值高出83%，可能原因为种子在发育过程中形成胚，胚具活性却未发育成熟而不具备发芽能力[25]。

GA3属于促进植物生长的一种植物激素，是通过促进植物细胞的分裂来调控促进物与抑制物之间的平衡来提高种子发芽力。试验结果表明，赤霉素浓度、处理时间均对堇菜属植物种子发芽率有影响，早开堇菜种子发芽时间最早，戟叶堇菜次之，其次为长萼堇菜、犁头草，紫花堇菜发芽最慢或不发芽；除紫花堇菜外，赤霉素处理可提高4种堇菜属植物种子发芽率、缩短种子发芽时间，综合经济成本及发芽水平，其余4种野生堇菜属植物种子在赤霉素浓度为500 mg/L下浸泡8 h效果最佳，该结果与卢精林等[26]的研究结果一致。野生紫花堇菜种子生活力低，6个月储存后发芽率为0，有效种实少且不耐储藏，推测由于紫花堇菜为5种野生堇菜属植物中唯一具地上茎的植物，种实采集位置可能会影响种子发芽率[27]，因此对其种子萌发试验有待进一步研究。