二维相关光谱结合移动窗口技术研究堆肥溶解性有机质演化*

刘洪宝，袁 英，宋彩红，单光春，4，虞敏达，崔 骏，何小松

（1.桂林理工大学环境科学与工程学院，广西 桂林 541006；2.中国环境科学研究院国家环境保护地下水污染模拟与控制重点实验，北京 100012；3. 聊城大学生命科学学院，山东 聊城252000；4.哈尔滨工业大学环境学院，黑龙江 哈尔滨 150090）

1 引言

随着人口的不断增加，有机废物（如餐厨废物、生活垃圾和畜禽粪便等） 的产生量也随之增加，给环境造成了巨大压力，也增加了废物管理的成本［1］。由于具有资源化和无害化等特点，堆肥成为有机固体废物处理处置的重要途径之一［2］。工艺的优化和产品的质量决定了堆肥工艺的未来前景［3］。堆肥是一个在微生物参与下的有机质降解和腐殖化过程，堆肥腐殖化是在微生物的作用下，可生物降解的大分子有机物（蛋白质、有机酸和可溶性糖等） 被降解为小分子有机化合物，剩下较难分解的有机物质（纤维素、半纤维素和木质素） 被分解并聚合形成复杂顽固的大分子有机物质——腐殖质［4-5］。在此过程中，溶解性有机质（DOM） 参与了多种生化反应，可直接反映堆肥过程物质转化［6］，能更好表明堆肥物料的稳定性［7］，是评价堆肥工艺和腐殖化程度的重要指标。

光谱分析检测技术具有选择性强、灵敏度高、取样少等优点。紫外光谱、傅立叶变换红外光谱、荧光光谱以及核磁共振光谱等光谱技术已广泛应用于堆肥DOM 的相关研究［8-10］。目前国内外大多数研究往往先提取DOM，再通过光谱、波谱技术来表征其物质组成［11］。但堆肥DOM 成分复杂，不同结构的图谱互相重叠，限制了进一步解谱分析。因此，越来越多的研究者利用化学计量学进行解谱，如二维相关光谱和平行因子分析等联合光谱学方法，研究堆肥DOM 的组成特征和转化规律［7，12-14］。二维相关光谱将光谱扩展到三维，能有效解决不同光谱信号的重叠问题，还可以准确识别光谱信号的变化，具有揭示有机质演替时序的功能［15-16］。然而，目前的研究主要着重于分析有机质含量、种类等常规指标的变化，难以解释堆肥过程中有机质官能团及其核心碳骨架的演替规律，缺乏对腐殖化过程及其机制的深入认识。显然，寻找新的或简单的方法来表征堆肥过程的物质演变值得被高度关注。而移动窗口技术可以观察有机质随外界微扰的变化，可以确定有机质转化关键时间段［17-18］。

因此，本研究以厨余垃圾堆肥发酵为例，通过二维相关光谱和移动窗口技术，分析堆肥过程中有机质官能团和碳骨架的演替规律，为堆肥物质转化研究和工艺调控提供参考。

2 材料和方法

2.1 堆肥过程及样品采集

堆肥物料包括厨余垃圾10.5 kg（采集于食堂）、腐殖土9 kg（购于花卉市场）、木屑0.23 kg。堆肥物料混合物C/N 为25.4、含水率为60.7%。堆肥试验通过室内堆肥反应器（容积为34 L，高40 cm，直径33 cm） 进行，堆肥过程通风控制在0.5 L/（min·kg）。堆肥共持续47 d。于堆肥第0、3、6、8、13、19、35、47 天分别在反应器中心5、15、25 cm 深处采集样品并充分混合，以确保所采集的样品具有代表性。堆肥样品采集完成后立即冷冻干燥保存，并放置冰箱储存于-20 ℃以备后续的实验操作（DOM 提取和分析）。

2.2 DOM 提取及制备

根据Daniel 等的方法［19］，以固体与蒸馏水之比为10（g）：100（mL） 的堆肥物料中提取DOM。将得到的悬浮液摇24 h，然后以10 000 r/min 离心10 min，上清液通过0.45 μm 滤膜过滤后收集。再将滤液冷冻干燥，用于红外光谱（FTIR） 和13C 核磁固体共振光谱（NMR） 测试和分析。

2.3 仪器与数据分析

FTIR 使用日立EPI 红外光谱仪，将1 g 冷冻干燥的DOM 样品与300 g 干燥KBr 混合，然后将混合物在10 000 kPa 下压2 min，再以2 cm-1分辨率从4 000 cm-1到400 cm-1进行扫描［20］。NMR 使用Bruker 型AV-300 型光谱仪，采用频率为12 kHz，再循环延迟时间、接触时间和脉冲时间依次为1 s、2 000 μs 和2.4 μs［20］。

二维相关光谱（2DCOS） 是一种将光谱强度与外界干扰看作两个独立变量函数的技术，将二维相关分析引入光谱研究，可提高光谱的分辨率和重叠峰的分离度［17］。使用2D Shige 版本1.3 软件（Kwansei-Gakuin 大学，日本） 进行二维相关光谱和移动窗口分析，该软件是在广义二维相关分析理论的基础上开发出来的，对于该软件采用的算法Noda 和Ozaki 进行了详细描述［15］。以堆肥时间作为外部扰动，得到了一组随时间变化的FTIR和NMR 二维相关光谱的同步图和异步图。此外，对FTIR、NMR 数据采用移动窗口技术分析，移动窗口分析基本思路是，每次从所有样本中取出一部分进行分析，然后将“窗口”进行移动，再取另外一部分样本进行分析，得到整体中各个部分的局部信息，它不仅可跟踪反映某一官能团随微扰的改变，还能更清晰揭示出两个官能团之间随微扰变化的规律［21-22］，移动窗口技术详细分析计算过程见文献［17］。最后使用origin 8.0 进行图谱绘制。

3 结果与讨论

3.1 堆肥过程中有机质官能团演替特征

利用红外光谱结合二维相关光谱研究堆肥过程中DOM 的组成和演变规律。图1 为堆肥过程中DOM 红外光谱经二维相关分析得到的同步和异步图。同步图中包括自相关峰和交叉峰，对角线上的峰为自相关峰，对角线外的为交叉峰［23］。在同步图中出现了6 个自相关峰，分别在3 350/3 350、2 890/2 890、1 730/1 730、1 650/1 650、1 260/1 260、650/650 cm-1处，其强度依次为1 650/1 650 cm-1＞1 730/1730cm-1＞1260/1260cm-1＞3 350/3 350 cm-1＞2 890/2 890 cm-1＞650/650 cm-1。各红外光谱对应波段的归属如下［20，24-26］：在3 350 cm-1源于酚基的O H 伸缩振动，2 890 cm-1源于脂肪甲基或亚甲基C H 伸展振动，1 730 cm-1为羧基O C＝O振动，1 650 cm-1归因于蛋白质酰胺基的C＝O，1 260 cm-1是由醇、酯、醚及羧酸的C O 伸缩引起的，而650 cm-1归因于胺的C H 或N H非平面振动。同时，在3 350/2 890、3 350/1 730、3 350/1 650、3 350/1 260、1 650/1 260、1 650/650、1 260/650 cm-1处出现正交叉峰，这7 个正交叉峰的存在表明堆肥过程脂肪、蛋白质、多糖以及醇、酯、醚等转化方向一致。此外，还存在3 个负交叉峰：1 730/1 260、1 730/650、2 350/1 730 cm-1，2 350 cm-1为C C 或C＝N 拉伸［14］，以上结果显示堆肥过程中羧基与胺、酰胺转化方向不一致，可能堆肥过程羧基等结构转化为二氧化碳和水，而在此时酰胺和胺结构可能与木质素酚等形成了腐殖质。

与同步图相比，在二维红外相关光谱的异步图中只检测到交叉峰。如图1（b） 所示，有7 个主要的负交叉峰（3 350/650、3 350/1 260、3 350/1 650、3350/2890、1650/650、1650/1260、1260/650 cm-）1，和3 个主要的正交叉峰（2 890/650、2 890/1 250、2 890/1 650 cm-）1。根据Noda 规则［15］，可以推断出堆肥过程不同官能团的变化时序为2 890 cm-1＞650 cm-1＞1 260cm-1＞1 650 cm-1＞3 350 cm-1，即堆肥过程有机质转化时序为：脂类→胺→醇、酯、醚→蛋白类→木质素酚。

图1 二维红外相关光谱

为了进一步确定堆肥过程中有机质官能团转化关键阶段，引入了移动窗口技术［17］，结果如图2 所示。从图2 可以看到，堆肥初期的第3 天，在1 260 cm-1和1 650 cm-1处出现弱的红外光谱峰，说明堆肥的第3 天，醇、酯、醚和蛋白类发生了降解和转化，这与此阶段处于升温末期，微生物活动将可生物降解的有机物降解为小分子有机化合物有关［20，27］，因此第3 天可能是物质变化明显的时间拐点。随后处于高温期，微生物活动受到抑制，有机质转化缓慢。同时可观察到，堆肥腐熟期（第13～35 天） 在650、1 260、1 650、1 840、2 890、3 350 cm-1处出现红外光谱峰，峰的强度变化为1 650 cm-1＞1 260、1 840 cm-1＞2 890、3 350 cm-1＞650 cm-1，说明第13～35 天蛋白质、醇、酯、醚、脂类、胺均发生了显著变化，而胺仅在第13～35 天观察到变化，可能由于蛋白质类化合物降解慢于脂类物质，初期胺类物质降解缓慢［28］，这也说明了移动窗口技术能揭示物质随时间扰动而发生显著变化。此外，发现堆肥发酵的第19 天，1 500、1 840 cm-1处出现了红外光谱峰，这与木质纤维素和酰胺相关，意味着这一阶段可能发生木质纤维素与酰胺聚合形成了腐殖质类物质。综上分析表明，在堆肥过程中第3 天和第13天是物质转化明显的时间点，堆肥后期（第13～35天） 物质转化明显，其中酰胺基和酚羟基变化最为明显，可能与这一阶段处于堆肥腐熟期，腐殖质大量形成有关［29］。

图2 移动窗口红外光谱

3.2 堆肥过程中有机质碳骨架演替规律

核磁共振光谱可提供碳骨架的相关信息，常被用于有机质碳骨架的研究［6，20］。如图3（a） 所示，在二维核磁共振相关谱中检测到5 个自相关峰，分别为170/170 δ、128/128 δ、70/70 δ、55/55 δ、30/30 δ，各峰的强度顺序为：30/30 δ＞170/170 δ＞128/128 δ＞55/55 δ＞70/70 δ。根据前人研究报道［20，30-32］，30 δ 为CCH2、55 δ 为NCH 或OCH3、70 δ 为OCH、128 δ 为芳香碳，170 δ 为COO 和N C＝O。因此，上述结果表明有机碳的敏感度为：CCH2＞COO 和N C＝O ＞芳香碳＞NCH 或OCH ＞OCH3，这是由于微生物优先利用易降解物质如小分子糖类、蛋白质等进行快速生长和繁殖［33］。另外，根据图3（a） 所检测到的正交叉峰，表明核磁共振光谱中30 δ、55 δ、70 δ、128 δ、170 δ 的峰呈正相关，说明在堆肥过程中酰胺、芳香碳、多糖转化方向一致，即均发生降解。

异步图如图3 （b） 所示，在55/30 δ、128/28 δ、 128/30 δ、 128/70 δ、 150/30 δ、175/30δ 附近有6 个主要正交叉峰，同时在30/28δ和30/25 δ 附近出现2 个负交叉峰，根据先前研究报道［34］，25 δ 为CCH3，28 δ 为CCH2，因此说明CCH3变化/降解比CCH2慢。根据Noda 规则［15］，堆肥过程中峰的变化顺序为：175δ、150δ、128 δ 和55 δ ＞28 δ 和25 δ＞30 δ。因此，堆肥过程中有机碳的转化时序为：酰胺、多糖→甲基→亚甲基。由于烷基碳结构并不稳定，部分烷基碳在堆肥过程中可以被微生物用作碳源消耗，而稳定性较好的烷基则作为腐植酸的组分发挥其功能［31］。

图3 二维核磁共振相关光谱

采用移动窗口技术来进一步揭示堆肥过程中有机质碳骨架的阶段性变化，结果如图4 所示，可看到堆肥初期的第3～6 天，在175 δ、128 δ、55δ、30δ 处出现核磁波谱峰，说明羧基、酰胺基、芳香基或者OCH3以及亚甲基发生结构性变化，此时间段为有机质碳骨架变化明显的时间段，这与上述官能团变化的时间不太吻合，可能由于有机质被降解的同时产生大量热能，堆肥物料温度快速升高从而引起碳结构变化［27］。根据Yuan 等［20］报道此时堆体温度近乎达到68 ℃。有机物物质的变化可能并未引起有机碳结构的变化，堆肥前期溶解性有机物物质结构不够稳定，易于被降解或发生构象变化［20］。随着堆肥的进行，在堆肥第19～35天175 δ、128 δ、55 δ、30 δ 处也出现波谱峰，峰的强弱顺序为：30 δ＞175 δ＞128 δ＞55 δ，其所对应的碳骨架均发生结构变化，表明第19～35天是有机质碳骨架变化明显的时间段。另外，与第3～6 天相比，第19～35 天的NCH 或OCH3、COO 和N C＝O、CCH2的碳骨架变化增强，而芳香碳骨架的变化减弱。此阶段处于堆肥腐熟期，随着堆肥进行，易降解的多糖类小分子物质和脂肪族含量减少，芳香性增强，从而形成稳定的芳香碳骨架［21］。综上分析，表明在堆肥过程中，第3～6 天和第19～35 天是有机质碳骨架演变明显的时间段，其中CCH2的碳骨架变化在两时间段最为明显。

图4 移动窗口核磁共振光谱

二维异质相关光谱常被用于检测两种不同光谱的共变特征［18］。正相关说明两种不同光谱强度变化一致或存在相似来源。为了进一步研究堆肥过程中有机质官能团与有机碳结构的关联，得到了NMR 和FTIR 光谱之间的异质二维相关光谱图。如图5（a） 所示：在25 δ、50 δ、125 δ 与1 300 cm-1附近观察到3 个较明显的正相关峰，表明CCH3（25 δ）、NCH 或OCH3（50 δ）、芳香碳（125 δ）与醇类、酯类、醚类及羧酸物质（1 300 cm-1） 有相似来源［35］。另外在30 δ、50 δ、75 δ、125 δ、170 δ 与1 840 cm-1存在的5 个正相关峰，表明CCH2（30 δ）、NCH 或者OCH3（50 δ）、OCH（75δ）、芳香碳（125δ）、COO和N C＝O（170δ）与蛋白质酰胺基的C＝O（1 840 cm-1） 有着相似的来源。同时在125 δ 与3 350 cm-1附近的正相关峰，说明芳香碳（125 δ） 与酚基（3 350 cm-1） 有相似来源。以上分析表明，醇类、酯类、醚类及羧酸类物质，蛋白质酰胺类物质和酚基类物质存在相同的物质中，即可能发生了腐殖化形成了腐殖质。在图5（b）异步图，可看到25δ、50δ、125 δ与1 300 cm-1附近观察到的正相关峰，表明醇类、酯类、醚类及羧酸物质（1 300 cm-1） 比CCH3（25 δ）、NCH 或OCH3（55 δ）、芳香碳（125 δ）优先变化。同时30 δ、50 δ、75 δ、125δ、170δ与1 840 cm-1存在的负相关峰，表明蛋白质酰胺基C ＝O 的变化慢于CCH2（30 δ）、NCH 或 者OCH3（50 δ）、OCH（75 δ）、芳香碳（125 δ）、COO 和N C＝O（170 δ）。另外3 350 cm-1与125 δ 附近的正相关峰，表明酚基（3 350 cm-1）比芳香碳（125 δ） 优先变化。以上分析表明，醇类、酯类、醚类及羧酸类物质，蛋白质酰胺类物质和酚基类物质具有较高的芳香性和共轭键官能团。

图5 二维FIRT/NMR 异质相关光谱图

4 结论

二维红外相关光谱和移动窗口分析表明，有机质官能团降解顺序为：脂类→胺→醇、酯、醚→蛋白类→木质素酚，在堆肥后期（第19～35天） 酰胺基的C＝O 或芳香环C＝C 演变最为明显，意味着这一时期可能发生腐殖化形成了腐殖质。二维核磁共振波谱显示，有机碳骨架的降解顺序为COO 和N C＝O、NCH 或OCH3→CCH3→CCH2。再结合移动窗口分析表明堆肥高温期（第3～6 天） 和腐熟期（第13～19 天） 碳骨架（NCH或OCH3、COO 和N C＝O、CCH2） 演变明显，其中CCH2最为明显。基于以上对有机质分子层面结构转化规律认识，可知在堆肥升温末期和腐熟期有机质转化剧烈，后续研究可考虑控温、接种微生物以改善堆肥过程中的生化特性。例如，在升温期可人为适当提高温度或延长升温期以缩短堆肥周期、提高堆肥腐殖化效率，或者适当添加嗜热微生物以加速有机质降解。本研究揭示了堆肥过程物质转化特征和关键节点，为餐厨垃圾处理设备的调控与优化提供参考，进而提高餐厨垃圾处理效率，降低其环境卫生危害。