紫归长皮软膏促进大鼠难愈性创面CGRP的分泌

王永灵 蒉纲 廖明娟 李琰

难愈性创面是指多种原因导致的难以在预期时间内自行修复的创面，临床中较为常见，近年来发生率呈上升趋势[1]。难愈性创面的病程及疗程均较长，创面上覆盖坏死组织，长期不液化，阻碍肉芽组织生长，部分肉芽组织暗红、老化，临床治疗效果不明显。紫归长皮软膏是我院自制的传统制剂，临床治疗难愈性创面效果非常明显[2]，具有促进创面内坏死组织液化、肉芽转红，促进愈合的作用。本实验旨在探讨紫归长皮软膏对大鼠难愈性创面组织神经修复环节的影响机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

32只雄性清洁级SD大鼠，体质量162～200 g，平均(181.04±7.21)g，由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供，许可证号为SCXK(沪)：2008-0016。随机分为4组：正常空白组、模型空白组、紫归长皮软膏组和贝复济组，每组8只。

1.2 实验药物

贝复济(63 000 IU/瓶)，为珠海亿胜生物制药有限公司生产(批准文号：国药准字S10980077)；紫归长皮软膏(沪药制字Z05060611)，我院制剂室提供。0.9%生理盐水，上海长征富民金山制药有限公司生产(批准文号：国药准字H31021918)；戊巴比妥钠，上海中医药大学动物房配置提供；氢化可的松琥珀酸钠(每支50 mg)，天津生物化学制药有限公司生产(批号：20101010)。

1.3 试剂与仪器

免疫组织化学-链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法试剂盒(美国Zymed公司)；辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠抗体(北京中山生物技术有限公司)；CGRP一抗(兔抗鼠，1∶50稀释，美国Santa Cruz公司)；EnVision试剂(HRP/Rabbit，抗兔即用型，丹麦Dako公司)；生物素标记的羊抗兔免疫球蛋白G(德国Vector公司)。

上海中医药大学基础医学院实验室提供的仪器与设备：IMS细胞图像分析仪系统和医学图像分析软件(上海申腾信息技术有限公司)；摄像机(MV-CP410，日本Panasonic公司)；光学显微镜(日本Olympus公司)；切片机(RM2145，德国Leica公司)；电热恒温水浴锅(DK-S22，上海精宏实验设备有限公司)。

1.4 方法

1.4.1造模方法[3]

除正常空白组常规饲养外，其余3组大鼠均肌内注射氢化可的松琥珀酸钠(80 mg/kg)，连续3 d。第4天进行创面造模。4组大鼠均腹腔注射戊巴比妥钠(0.02 mg/kg)，麻醉成功后于造模区(腰椎正中偏上)剃毛，标记15 mm圆形造模区域，消毒，沿标记线剪去皮下组织至肌筋膜，制成大鼠全层皮肤缺损开放性创面模型。正常空白组、模型空白组采用生理盐水纱布覆盖伤口；贝复济组外用贝复济喷涂伤口；紫归长皮软膏组采用紫归长皮软膏外敷。各组创面处理后，均用无菌纱布包扎。模型空白组、贝复济组和紫归长皮软膏组于创面造模当天、次日分别肌注氢化可的松琥珀酸钠，完成难愈性创面模型。大鼠4只一笼饲养，自由进水饮食。造模后各组每天换药1次。换药时均用0.1%利凡诺溶液消毒伤口。分别于第7天及第10天取创面组织标本。

1.4.2CGRP免疫组化

组织标本石蜡包埋切片，常规脱蜡至水；PBS洗3 min，3次；用0.01 mol/L柠檬酸缓冲液(pH6.0)热诱导修复，室温自然冷却；PBS洗3 min，3次；0.3% H2O2抑制内源性过氧化物酶20 min；PBS洗3 min，3次；20%正常羊血清室温孵育30 min，不洗；滴加CGRP一抗，37 ℃孵育2 h；PBS洗3 min，3次；EnVision试剂37 ℃孵育30 min；PBS洗3 min，3次；DAB显色8～12 min；苏木精衬染，热水蓝化；吹干后，树脂封片；镜下观察，背景呈紫蓝色，阳性产物呈棕黄色或黄色。

通过显微镜、图像采集卡、摄像机或数码相机采集数字图像。测定图像中阳性区域面积和光密度值，两者的乘积代表CGRP表达水平。每张切片分析3个视野，取其平均值。

1.5 统计学方法

2 结果

CGRP阳性染色呈棕黄色或褐色，主要分布在胞质或间质中。由于染色分布面积有大小，染色的强弱并不均匀，故以阳性区域面积百分比(染色分布)和光密度值(染色的强弱)的乘积来进行比较。

正常空白组、模型空白组、紫归长皮软膏组及贝复济组均有CGRP表达，散在分布，阳性染色多分布于纤维上，也可见成纤维细胞及血管内皮细胞被染(图1)。

A：正常空白组造模第7天；B：正常空白组造模第10天；C：模型空白组造模第7天；D：模型空白组造模第10天；E：紫归长皮软膏组造模第7天；F：紫归长皮软膏组造模第10天；G：贝复济组造模第7天；H：贝复济组造模第10天A: At modeling day 7 of normal blank group; B: At modeling day 10 of normal blank group; C: At modeling day 7 of model blank group; D: At modeling day 10 of model blank group; E: At modeling day 7 of Zigui Changpi Paste group; F: At modeling day 10 of Zigui Changpi Paste group; G: At modeling day 7 of bfgf-torita group; H: At modeling day 10 of bfgf-torita group图1 各组组织学观察Fig. 1 Histological observation of each group

如图2所示，在创伤第7天，各组分别进行两两比较，各组间CGRP表达均有显著性差异(P<0.05)，CGRP相对表达量由高到低分别为紫归长皮软膏组、正常空白组、模型空白组、贝复济组。在创伤第10天，各组间CGRP表达亦存在显著性差异(P<0.05)，CGRP相对表达量由高到低分别为紫归长皮软膏组、正常空白组、模型空白组、贝复济组。另外，创伤后第10天与第7天相比，各组CGRP表达均有显著下降(P<0.05)。

图2 各组大鼠创面的CGRP表达Fig. 2 CGRP expression of the wound in each group

3 讨论

神经营养因子在难愈性创面的愈合过程中十分重要[4]。降钙基因素相关肽(CGRP)是一种神经肽，它的表达不仅与神经损伤及修复再生有一定的相关性，在创面愈合中还具有多种作用[5-6]，可促进培养的成纤维细胞迁移，加速细胞分裂、增殖，并可促进伤后血管形成[7-9]。神经肽还能作用于免疫系统的巨噬细胞、肥大细胞、白细胞介素等构成神经免疫反应，通过调节这些细胞的功能而影响其释放细胞因子及生长因子，从而参与创伤修复中细胞增殖、分化的调节[10-11]。

紫归长皮软膏由当归、生地、紫草、地骨皮、大黄、象皮粉等组成，具有祛腐托腐、补血活血、生肌长肉的作用[12-13]，临床治疗难愈性创面的效果非常明显。本实验以贝复济为对照，并设正常空白组、模型空白组，观察紫归长皮软膏对大鼠难愈性创面神经修复的影响机制。结果显示，CGRP在各组创伤后第7天及第10天时均有表达，表明CGRP参与创面的修复过程。贝复济组的CGRP表达明显低于其他各组，说明其对CGRP的表达可能产生了抑制作用，具体机制还有待进一步探讨。紫归长皮软膏在创伤后第7天及创伤后第10天CGRP的表达均明显高于其他各组，表明紫归长皮软膏具有促进创面CGRP的表达，进而促进创面愈合的作用。我们还发现，创伤后第10天与第7天相比，各组CGRP表达均有显著下降(P<0.05)，这可能是因为创伤后第10天，创面已接近愈合，伤口表面需要的神经营养因子逐渐减少的缘故；另外，CGRP除了来源于感觉神经末梢外，炎症细胞(巨噬细胞)也是一个重要来源[14]，因此该结果也可能与炎症减轻有关。