一测多评法测定白芍中3种芍药苷类成分的含量

张洪坤 郭长达 杨美华 路丽 高贯彪 吴韶辉

摘要[目的]建立测定白芍中3种芍药苷类成分含量的一测多评法。[方法]采用HPLC法，以芍药苷为对照品，同时测定芍药内酯苷和苯甲酰芍药苷的相对校正因子，建立一测多评的方法，并用该方法测定不同产地白芍中3种芍药苷类成分的含量。[结果]一测多评法与外标法测定结果无明显差异，RSD均小于5.00%，各相对校正因子准确度、重现性良好。[结论]一测多评法的适用性和可行性在白芍3种芍药苷类成分的含量测定中得到较好的验证，可用于白芍的定量分析及质量评价。

关键词白芍;芍药苷;一测多评法;相对校正因子;含量

中图分类号R284.1文献标识码A 文章编号0517-6611（2020）15-0211-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.15.060

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Simultaneous Determination of Three Paeoniflorins in Radix Paeoniae alba by QAMS Method

ZHANG Hongkun1， GUO Changda1， YANG Meihua2 et al

（1. Bozhou Huqiao Pharmaceutical Co.， Ltd.， Bozhou， Anhui 236800;2. Institute of Medicinal Plant Development， Peking Union Medical College， Chinese Academy of Medical Sciences， Beijing 100193）

Abstract[Objective] To establish a method of quantitative analysis of multicomponents by singlemarker（QAMS） for determination of three paeoniflorins in Radix Paeoniae alba. [Method]Using paeoniflorin as the contrast， the relative correction factors（RCF） of albiflorin and benzoyl paeoniflorin were determined by HPLC.And using the QAMS to determine the three paeoniflorins in Radix Paeoniae alba.from different areas. [Result] There was no obvious difference between the results of the QAMS method and the external standard method，RSD were all less than 5.00%， and the accuracy and reproducibility of each relative correction factor were good.[Conclusion]The QAMS is verified in the determination of three paeoniflorins in Radix Paeoniae alba.It can used for quantitative analysis and quality evaluation of Radix Paeoniae alba.

Key wordsRadix Paeoniae alba;Paeoniflorin;Quantitative analysis of multicomponents by singlemarker（QAMS）;Relative correction factor;Content

基金項目安徽省科技重大专项（18030801119）;国家中医药管理局中药标准化项目（ZYBZH-Y-AH-03）。

作者简介张洪坤（1986—），男，安徽阜阳人，副主任中药师，硕士，从事中药研发及其质量评价研究。

收稿日期2020-02-11

白芍首载于《神农本草经》，为毛茛科多年生草本植物芍药（Paeonia lactiflora Pall.）的干燥根，已有2 000多年的药用历史，具有养血调经、敛阴止汗、柔肝止痛、平抑肝阳之效[1]，临床应用广泛。白芍总苷（total glucosides of paeony，TGP）为白芍中提取的有效成分，主要含有芍药苷、芍药内酯苷、羟基芍药苷、苯甲酰芍药苷等单萜苷类化合物，其中以芍药苷最为典型，含量占芍药总苷中总苷量的90%以上[2]。白芍总苷的药理及临床研究发现，白芍总苷具有止痛、抗炎、保肝以及多途径抑制自身免疫反应等多种药理作用，对类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等自身免疫病有确切的疗效[3]。

2015年版《中国药典》仅以芍药苷为其含量的检测指标，尽管芍药苷含量较高，但仍难以真正体现和保障白芍的内在质量，传统中医的整体观要求对中药材进行多药效成分指标的综合评价，但长期以来一直面临对照品难得、货源紧缺和检测成本昂贵的问题，限制了同时对白芍中3种芍药苷类成分进行含量测定在实际工作中的应用。

一测多评法（quantitative analysis of multicomponents by singlemarker，QAMS）是一种用于多成分含量控制的研究思路，已在木通[4]、人参[5]、黄连、丹参等药材中得到验证。周光姣等[6]建立一测多评法测定白芍中没食子酸、苯甲酸、苯甲酰芍药苷、芍药内酯苷和芍药苷5种成分含量，由于指标成分太多在实际应用中较难实现质量监测，对此，笔者仅选择白芍中3种芍药苷类成分建立一测多评方法，以期实现白芍芍药苷类成分的质量控制，即应用供应量大、价格较低的芍药苷对照品作为内标物，通过建立其与芍药内酯苷、苯甲酰芍药苷的相对校正因子（the relative correction factor，RCF）、相对保留时间（the relative retention time，RRT），计算其成分的含量，实现多指标的质量控制。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1仪器。DIONEX Ultimate 3000高效液相色谱系统，Agilent 1200系列高效液相色谱系统，Waters 2695高效液相色谱系统，色谱柱Agilent ZORBAX SB-C18（5 μm，250 mm×46 mm），色谱柱Waters XBridgeC18（5 μm，250 mm×4.6 mm），色谱柱Thermo AcclaimTM 120-C18（5 μm，250 mm×4.6 mm），XS204型电子天平（d=0.1 mg，Mettler Toledo），MX5型电子天平（d=0.001 mg，Mettler Toledo），RHP-100型高速多功能粉碎機（浙江永康市荣浩工贸有限公司），DHG-9245A型电热鼓风干燥箱（上海市一恒科学仪器有限公司），KQ-500DA型数控超声波清洗仪（40 kHz&500 W，昆山市超声仪器有限公司）。

1.1.2试药。芍药苷（110736-201539，中国食品药品检定研究院，纯度96.4%）;芍药内酯苷（成都曼思特生物科技有限公司）;苯甲酰芍药苷（MUST-16061803，成都曼斯特有限公司，纯度99.28%）;乙腈（色谱纯，Merck）;磷酸（HPLC级，阿拉丁）;水为超纯水;其他试剂均为分析纯。

1.1.3样品。白芍药材于2017年先后自安徽、山东、山西、湖南、河南、四川、浙江等白芍主产区收集，经鉴定为毛茛科植物芍药（Paeonia lactiflora Pall.）的干燥根。样品来源信息见表1。

1.2方法

1.2.1色谱条件。色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18（5 μm，250 mm×4.6 mm）;流动相为乙腈（A）和0.015%磷酸（B），按表2中的规定进行梯度洗脱;流速1.0 mL/min，柱温30 ℃，检测波长230 nm，进样量5 μL。

1.2.2对照品混合储备液的制备。分别取芍药内酯苷、芍药苷、苯甲酰芍药苷对照品适量，精密称定，加50%甲醇溶解，配制成含芍药内酯苷0.16 mg/mL、芍药苷0.25 mg/mL、苯甲酰芍药苷0.015 mg/mL的混合对照品储备液，即得。

1.2.3芍药苷对照品溶液的制备。取芍药苷对照品适量，精密称定，加甲醇溶解，配制成0.06 mg/mL的单标溶液，即得。

1.2.4供试品溶液的制备。取白芍中粉约0.1 g，精密称定，置50 mL容量瓶中，加稀乙醇35 mL，超声处理（功率240 W，频率45 kHz）30 min，放冷，加稀乙醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

1.2.5方法学考察。

1.2.5.1线性范围。取“1.2.2”的混合对照品储备液，准确稀释1、2、4、5、10、20倍，配制成系列的混合对照品溶液，每个浓度分别进样5 μL，以各对照品的峰面积（Y）为横坐标、进样量（X）为纵坐标绘制标准曲线，进行线性回归。

1.2.5.2精密度试验。精密吸取同一混合对照品溶液5 μL，连续进样6次，记录峰面积RSD。

1.2.5.3稳定性试验。取同一供试品溶液，分别于放置0、2、4、6、8、12、24 h时进样分析，测定各待测物峰面积，计算含量RSD。

1.2.5.4重复性试验。取同一批白芍粉末，按“1.2.4”方法制备供试品溶液6份，测得芍药内酯苷、芍药苷、苯甲酰芍药苷含量的RSD。

1.2.5.5加样回收率试验。精密称取适量已知含量的白芍中粉6份，分别加入一定量的对照品，按“1.2.4”方法制备样品，测定含量，计算加样回收率。

1.2.6相对校正因子和相对保留时间计算。取“1.2.2”项下配制的系列浓度的混合对照品溶液，每个浓度分别进样5 μL。以芍药苷为内标，按公式fsi=fsfi=As/CsAi/Ci（As为参照物峰面积，Cs为参照物浓度，Ai为其他组分i峰面积，Ci为其他组分i浓度）和Rtis=tRi/tRs（tRs为参照物保留时间，tRi为其他组分i保留时间），分别计算芍药苷对芍药内酯苷和苯甲酰芍药苷的相对校正因子和相对保留时间。

1.2.7耐用性考察。

1.2.7.1不同波长的影响。考察228、230、232 nm不同波长对校正因子的相对保留时间的影响，计算不同波长下的校正因子和相对保留时间的RSD。

1.2.7.2不同色谱柱及高效液相色谱系统的影响。考察不同色谱柱、色谱系统对校正因子和相对保留时间的影响，计算不同色谱柱、色谱系统的校正因子和相对保留时间的RSD。

1.2.7.3不同流动相pH的影响。考察3个不同流动相pH体系（0.01%磷酸溶液、0.015%磷酸溶液、0.02%磷酸溶液）对相对校正因子和相对保留时间的影响，计算不同流动相pH体系的校正因子和相对保留时间的RSD。

1.2.7.4不同柱温的影响。考察不同柱温（25、30、35 ℃）对校正因子和相对保留时间的影响，计算不同柱温条件下的校正因子和相对保留时间的RSD。

1.2.7.5不同流速的影响。考察不同的流速（0.8、1.0、1.2 mL/min）对校正因子和相对保留时间的影响，计算不同流速条件下的校正因子和相对保留时间的RSD。

2结果与分析

2.1方法学考察

2.1.1对照品与样品的高效液相色谱峰图。从图1可以看出，在相同的色谱条件下，样品在对照品相同出峰时间中均有相应的峰出现，且该条件下样品中的目标峰与相邻峰的分离度较大，空白无干扰，说明此条件适合测定芍药苷、芍药内酯苷和苯甲酰芍药苷的含量。

2.1.2线性范围。以各对照品的进样量对峰面积进行回归处理，得芍药内酯苷、芍药苷和苯甲酰芍药苷的回归方程及相关系数r，结果表明（表3），各对照品的进样量与峰面积均呈良好的线性关系。

2.1.3精密度试验。按照“1.2.5.2”方法操作，结果显示，芍药内酯苷、芍药苷、苯甲酰芍药苷的峰面积RSD分别为05%、0.9%、0.8%，RSD均小于2.0%，说明仪器精密度良好。

2.1.4稳定性试验。按照“1.2.5.3”方法操作，结果显示，0～24 h芍药内酯苷、芍药苷、苯甲酰芍药苷的含量RSD分别为1.3%、0.9%、2.7%，RSD均小于3.0%，说明处理后的样品溶液中芍药内酯苷、芍药苷和苯甲酰芍药苷在24 h内较为稳定。

2.1.5重复性试验。按照“1.2.5.4”方法操作，测得芍药内酯苷、芍药苷、苯甲酰芍药苷的平均含量分别为0.678%、3170%、0.085%，RSD分別为1.10%、0.90%、2.80%，RSD均小于3.00%，说明该方法重复性良好。

2.1.6加样回收率试验。按照“1.2.5.5”方法操作，结果显示，芍药苷、芍药内酯苷、苯甲酰芍药苷的加样回收率分别为95.9%、98.5%、103.3%，RSD分别为1.60%、1.60%、1.30%，表明该方法回收率较好，方法可行。

2.2相对校正因子和相对保留时间计算分别计算芍药苷对芍药内酯苷和苯甲酰芍药苷的相对校正因子和相对保留时间，取平均值，结果表明（表4），以芍药苷为参照物，芍药内酯苷和苯甲酰芍药苷的响应因子分别为1.072 7和0654 1，相对保留时间分别为0.899 0和2.147 2，RSD均小于2.00%。

2.3耐用性考察

2.3.1不同波长的影响。从不同波长对校正因子和相对保留时间的影响（表5）可以看出，波长变化对校正因子和相对保留时间无明显影响，通常控制波长为230 nm即可。

2.3.2不同色谱柱及高效液相色谱系统的影响。从不同色谱柱、色谱系统对校正因子和相对保留时间的考察结果（表6）可以看出，各成分校正因子的RSD在1.20%～2.30%，相对保留时间的RSD在0.80%～3.50%，表明该方法耐用性良好。

2.3.3不同流动相pH的影响。不同流动相pH体系（001%磷酸溶液、0.015%磷酸溶液、0.02%磷酸溶液）对相对校正因子和相对保留时间的影响（表7），流动相pH对各成分的校正因子、相对保留时间影响较小，耐用性良好。

2.3.4不同柱温的影响。从不同柱温（25、30、35 ℃）对校正因子和相对保留时间的影响（表8）可以看出，柱温对各成分的校正因子、相对保留时间影响较小，通常情况下可以选择30 ℃进行试验。

2.3.5不同流速的影响。从不同的流速（0.8、1.0、1.2 mL/min）对校正因子和相对保留时间的影响（表9）可以看出，流速对各成分的校正因子、相对保留时间影响较小，耐用性良好。

2.4含量的测定

分别采用一测多评法和外标法计算白芍样品中芍药苷、芍药内酯苷、苯甲酰芍药苷的含量，结果见表10。常规的外标法实测含量与一测多评计算的含量值经t检验比较，P>0.05，表明一测多评法与外标法所测定的芍药苷、芍药内酯苷、苯甲酰芍药苷的含量无明显差异，RSD<5%，表明一测多评法可以用来测定白芍中3种芍药苷类成分的含量。

3讨论

在参考《中国药典》[7]、查阅文献的基础上[8-10]，该试验分别考察了甲醇、50%甲醇、乙醇、稀乙醇等不同提取溶剂，超声、回流等不同提取方法，发现药典的提取方法能够兼顾芍药苷类成分，得到满意的提取率，杂质干扰峰较少，且方法简单，故该研究将其作为此次试验的提取条件。

该研究采用HPLC法，以芍药苷为对照品，用外标法测定了其在白芍药材中的含量，计算芍药内酯苷、苯甲酰芍药苷的相对校正因子，然后用获得的相对校正因子计算芍药内酯苷、苯甲酰芍药苷的含量，实现一测多评。再用外标法测定了白芍药材中芍药内酯苷、苯甲酰芍药苷的含量，比较了其与采用相对校正因子计算值之间的差异，结果表明各成分采用相对校正因子计算的含量值与外标法测定值之间无显著性差异。一测多评法的适用性和可行性在白芍3种芍药苷类成分含量测定中得到了验证。该法在兼顾药典指标的同时还能兼顾其他成分的质量控制，在不增加成本的同时实现了白芍质量控制的提升，可用于白芍的定量分析及质量评价。

参考文献

[1] 刘晓龙，刘大培，尚志钧.白芍、赤芍的本草考证[J].中国药学杂志，1993，28（10）：626-628.

[2] 高小荣，田庚元.白芍化学成分研究进展[J].中国新药杂志，2006，15（16）：416-418.

[3] 韩珍，贺弋.白芍总苷的药理作用及其毒性研究进展[J].宁夏医学院学报，2008，30（4）：538-541.

[4] 王智民，高慧敏，付雪涛，等.“一测多评”法中药质量评价模式方法学研究[J].中国中药杂志，2006，31（23）：1925-1928.

[5] 朱晶晶，王智民，匡艳辉，等.一测多评法同步测定人参和三七药材中多种人参皂苷的含量[J].药学学报，2008，43（12）：1211-1216.

[6] 周光姣，白华，权春梅，等.一测多评法测定白芍中的五种成分含量[J].皖西学院学报，2018，34（5）：85-88.

[7] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2015：105.

[8] 刘文斌，何振辉，宾漫容.中药白芍的HPLC含量测定及指纹图谱研究[J].光谱实验室，2010，27（2）：693-699.

[9] 李越峰，任彦冬，杨武亮.等.不同产地白芍芍药苷含量的测定和比较研究[J].长春中医学院学报，2005，21（4）：28-29.

[10] 张瑜，唐志书，张岗，等.白芍中芍药苷提取方法的比较研究[J].现代中医药，2013，33（1）：84-86，93.