将HPLC变成“绿色分析”方法

文/ Kerstin Hermuth-Kleischnidt, Thorsten Teutenberg, Tim Apel, Martin Jäger

与传统的HPLC相比较，μLC更加符合“绿色分析”的要求 // 几乎没有一种检测分析方法可以像HPLC那样在实验室中普遍应用了，但这种分析方法需要使用一些有害试剂，µLC则很好地解决了这一问题，使分析方法变得更加环保、安全、经济。

HPLC 高效液相色谱技术广泛地适用于食品、环境、制药、材料等各个领域的有机实验室中，主要用于常规检验分析、科学研究、质量控制以及环境保护和微量元素的痕迹检测等方面。HPLC 也用于危害健康和环境保护的低浓度有害物质检测分析，大多数情况下，分析这类物质所使用的分析检测方法属于资源密集型检测分析方法，按照EHS 环境保护、健康和安全标准来评判，其所使用的试剂属于危险试剂。而“绿色分析”的原理则展示了一种可持续性发展的高效液相色谱分析技术，也就是一种更加安全、更加生态和更加经济的液相色谱分析技术。

“绿色化学”是一种可持续性化学

化学能够做出什么样的贡献？现代化和可持续性发展的化学应该是什么样子的？ 1998 年时Paul Anastas 先生和John C.Warner 先生在《绿色化学》一书中提出了“绿色化学”的12 原则。为了正确地贯彻落实“绿色化学”的实施，近几年来“可持续性化学”一词也变得越来越流行。

液相色谱法是本世纪最重要的实验分析技术之一，各种不同变型的液相色谱分析技术都可以在化学分析、生物化学分析和药物研究以及常规分析中应用。因此，在实验分析技术领域中出现了“绿色色谱”之一词汇就不足为奇了。其实验分析方法就是满足“绿色化学”的12 项原则。而实现“绿色色谱”最有效的措施就是取代有毒有害的试剂的使用，以及使用小型化的实验分析设备。

可持续发展实验分析的评估方法

“绿色化学”的12 项原则只是提供了一个准则，仅凭这12 项原则还不足以全面地评估实验分析过程是否满足了“绿色分析”的要求。还需要根据具体的标准，能够定性的和定量的评估“绿色分析”过程中各个变量、参数，例如，在评判实验分析过程中使用的试剂，在实验分析方法的评判中，还要考虑其他评估标准，例如，每次实验分析时使用的试剂量，产生废弃物的量等等。下面介绍几种常用的实验分析过程评估方法：

第一种，国家环境方法索引NEMI，它是可以定性评估环境保护和安全的工具之一，但它只能提供是或者否两个答案。第二种，生态分析模型（Analytical Eco-Scale），与第一种评估方法不同，它能给出实验分析时所有试剂的类型和使用量，以及实验分析过程所消耗的能源和产生废弃物的量。各项数据汇总后换算出来得分，分数的大小代表了对环境影响的程度。另外，它可以对两种不同的分析方法进行比较。第三种，绿色分析程序指数GAPI，这种方法可以评估分析过程中的步骤，并以前两种评估方法为基础。第四种，HPLC 环境评估工具软件EAT（Environment Assessment Tool），这是专门为高效液相色谱分析开发的评估工具。用户可以免费地使用这款软件，并对不同的实验分析方法进行评估。它能根据实验分析过程中所用试剂的种类和用量，以及对环境、健康和安全的危害进行评分。得到的分数越低，则实验分析方法越安全、环保。

图1 利用EAT 环境评估工具软件对两种HPLC 液相色谱实验分析方法对环境、健康和安全相关性进行评估分析的结果对比

图2 HPLC 法和µLC-MS/MS 法所用试剂量的比较

开发可持续性发展的HPLC 分析方法

接下来我们在高效液相色谱-质谱法（HPLC-MS）和微量色谱质谱联用法（Mikro-LCMS/MS）两种液相色谱分析方法在地表水和废水中的微量元素测定的比较中介绍这一软件。两种液相色谱分析的流动相都是水和乙腈。使传统的HPLC，每次分析检测都使 用412 mL 的 水 和238 mL 的乙腈。而在微量色谱质谱联用法（简写为μLC）中，每次流动相的使用量只有150 mL（87 mL的水和52 mL 的乙腈），见图1。在使用µLC 之后，检测分析的时间也从传统方法的13 分钟缩短到3.5 分钟。

图2 表示的是从环境保护和安全保护的角度，EAT 用于确定HPLC 和µLC 实验分析方法对环境、健康和安全影响。按照EAT软件工具的评分办法，作为流动相的水对环境、健康和安全没有影响，得分为零分，只有乙腈会对环境、健康和安全造成影响。传统的HPLC 的EAT 环境评估值为8.52，µLC 的EAT 值仅为0.13，这就意味着µLC 与传统的HPLC 相比，对环境、健康和安全的影响降低了65 倍。

在经济性方面，µLC 也大幅度的降低了试剂消耗的成本费用。表1 所示就是两种实验分析方法进行了100 次分析实验时所消耗的试剂量。µLC 进行100 次分析实验仅消耗8.7 mL 的水和5.2 mL的乙腈（ACN），成本只有10 欧分左右。这也就意味着：与传统的HPLC 相比较，µLC 仅仅因节约试剂消耗量就降低了46 倍的成本费用。

从表1 中的数据对比可以看出：尽管试剂的消耗量是常规实验室中成本费用的一个组成部分，但它不是常规分析实验室成本费用中最大的组成部分。在常规分析实验室中可以显著降低成本费用的措施是减少了实验分析时间。实验分析时间的缩短大大的提高了样本通量，同时也降低了分析实验室的运营成本。

表1 试剂用量LM 成本计算示例

LP 本刊提示

“绿色化学”的12 个原则

1、直接方法优于间接方法；

2、样本数量和样本量的最小化；

3、优选在线测量；

4、实验分析过程和操作（在现有）过程中的集成，即节约能源也减少了试剂消耗量；

5、选择能够实现自动化和最小化的实验分析方法；

6、应避免衍生化作用；

7、避免产生实验分析废弃物，以及实验分析废弃物安全可靠的无害化处理；

8、优先选用能够同时完成几种分析和/或者完成多个实验参数分析的方法；

9、尽可能的减少能源消耗；

10、使用可再生原材料进行检测分析；

11、不使用有毒有害试剂/用无毒无害试剂替换；

12、用户的安全性最为重要，应有尽可能高的安全性。

Mikro-LC 方法的积极成效

与传统的HPLC 或者超高效液相色谱法（UHPLC）相比较，μLC 的经济优势和生态优势是无可置疑的。在常规实验室中使用这一分析方法，除了减少试剂消耗量和增加实验样本通量之类的优点之外，更重要的是这一分析方法不会导致数据质量的下降和实验过程的不稳定。基于多年来的实践经验，笔者认为这是一种完全理想的实验分析方法。