激光诱导击穿光谱的油茶炭疽病检测

刘燕德， 高 雪， 姜小刚， 高海根， 林晓东， 张 雨， 郑艺蕾

华东交通大学机电与车辆工程学院， 光机电技术及应用研究所， 江西 南昌 330013

引 言

油茶是我国南方特有的食用油料树种， 具有良好的生态经济效益。 目前， 产业面临的最大问题是如何提高油茶种植区产量。 油茶产量与油茶树生长的健康状态密切相关， 所以检测油茶病害是提高油茶产量的重要保障。 油茶炭疽病是长江流域以南各省油茶栽培区普遍发生的一种重要病害， 病害严重时会引起落果、 落蕾、 枝梢枯死， 甚至整株衰亡的现象[1]。 因此， 找到一种快速、 有效、 无损的油茶炭疽病检测方法， 对油茶产业健康持续发展具有重要意义。

油茶主要是大面积种植， 不可避免的会受到病害侵袭。 病害严重威胁着整个油茶产业的经济社会效益。 目前， 病害检测成为了大量研究人员讨论的热点问题。 熊朝伟[2]、 杨婷[3]等根据分析油茶炭疽病病原菌， 检测油茶炭疽病。 这种检测方法虽然具有较高的精度和灵敏度， 但对试验研究人员的技术要求高， 他们必须具备分析病菌能力、 且样品制备复杂、 试验产物对环境污染严重。 还有一些研究者尝试着用无损检测方法， 如伍南[1]等采用可见-近红外光谱技术和高光谱技术检测油茶炭疽病。

激光诱导击穿光谱技术(laser-induced breakdown spectroscopy, LIBS)[4]是一种可同时检测多元素的简便、 快速、 无损分析技术， 被灵活地应用在农业检测方面[5]。 赵贤德等利用纳米增强LIBS技术检测苹果表面农药残留， 检测到的毒死蜱农药检测限最低为1.61 μg·cm-2(见本刊39卷7期)； Jull[6]等采用LIBS技术对新鲜牧草和干燥牧草的营养水平进行了预测， 结果表明LIBS可以用来评估新鲜牧场的营养水平； Shukla[7]等利用LIBS技术检测了五种不同绿叶蔬菜中的矿物质分布。 Wang[8]等采用LIBS和判别分析(DA)相结合的方法， 对6种茶叶进行了分析鉴定， 其平均正确识别率高达95.33%。

目前， LIBS在油茶病害检测应用很少， 鉴于LIBS在众多植物病害检测方法中比较新颖和突出， 提出了基于LIBS的油茶炭疽病检测方法。 油茶叶片的生长情况直接反映油茶树及整个种植区油茶的健康程度。 以油茶健康叶片和感染炭疽病的叶片为研究对象， 研究健康叶片和感染炭疽病叶片的LIBS及其光谱响应。

1 实验部分

1.1 样品制备

油茶的健康叶片和感染炭疽病的叶片在2019年6月江西省南昌市的油茶林分散的采集了具有代表的两种叶片。 健康叶片指叶片表面光滑无任何病斑， 感染炭疽病叶片指黑褐色病斑的面积占总面积的1/4以上， 分别采摘100片。 由于天气炎热， 将采集的新鲜叶片装入保鲜袋中， 并将其与冰袋放在一起带回实验室， 可以保证叶片的新鲜程度， 用于LIBS光谱采集实验。 实验过程： 首先， 用实验室制备的去离子水反复冲洗叶片表面3次， 目的是去除油茶叶片表面上影响实验结果的一些污渍； 然后， 用吸水纸擦干， 放置通风处静置两小时自然风干， 减少叶片表面水珠对LIBS的影响； 最后， 装袋并分类标号。

1.2 LIBS设备

实验采用的LIBS设备是海洋光学的MX2500+， 如图1所示为LIBS系统原理图。 Q开关Nd∶YAG激光器激发出脉冲宽度为纳秒量级的较高能量激光， 经反射后， 由透镜聚焦到油茶叶片表面， 剥离叶片表面微量物质形成等离子体， 由光纤收集后传输给5个通道的多通道光谱仪中， 然后通过光谱仪配套的MaxLIBS软件设置参数， 进行元素的波长与信号强度的光谱采集。

图1 LIBS系统原理图

激光能量设置为50 mJ， 光谱仪的波长范围为198.71～727.69 nm， 光学分辨率0.1 nm， 延迟时间设为2 μs。 每个样本分散采集6个LIBS光谱数据值， 健康油茶叶片在避开叶脉处采集， 感染炭疽病的叶片在病斑周围(患病初期)采集， 将每个叶片采集到的LIBS光谱数据求其平均值， 目的是减小误差， 同时降低油茶叶片不平整对样品的影响。

1.3 数据处理

LIBS光谱信号受激光器激光能量的波动、 光谱仪分辨率的差异、 外部环境的差异以及样品不均匀等因素影响[9]， 为了有效地消除或减弱这些干扰信息， 对LIBS光谱数据进行光谱预处理。 通过对比分析了Savitzky-Golay卷积平滑法、 一阶导数和多元散射校正(MSC)三种光谱预处理方法， 最终发现MSC的预处理效果最好。

多元散射校正(multiplicative scatter correction, MSC)主要应用于固体漫反射和浆状物透(反)射光谱中， 目的是消除颗粒分布不均匀及颗粒大小产生的散射影响。 MSC算法是基于一组样品的光谱阵进行运算的， 具体算法如式(1)

xMSC=(x-b)

(1)

其中，x和b是通过计算样品的平均光谱， 并将x与进行线性回归：x=b0， 用最小二乘法求得x和b的值。

根据大量学者的研究文献和NIST(美国国家标准与技术研究院)的标准原子光谱数据库， 预选光谱Si(Ⅰ)251.432 nm， Fe(Ⅰ)252.285 nm， Fe(Ⅱ)259.837 nm， Fe(Ⅰ)385.991 nm， Mn(Ⅱ)260.568 nm， Mn(Ⅰ)279.482 nm和Mn(Ⅰ)280.108 nm七条LIBS光谱为分析油茶炭疽病的谱线。 这些微量元素与油茶叶片组织有内在的相关性， 即这些微量元素有可能区分出健康油茶叶片和感染炭疽病的油茶叶片。 采用软件Unscrambler 9.7中的主成分分析法(principal component analysis， PCA)和偏最小二乘判别分析[10](partial least square discriminant analysis， PLS-DA)对LIBS光谱数据进行分类处理。

2 结果与讨论

2.1 叶片LIBS光谱特征分析

图2为Si和Fe的LIBS光谱。 短划线表示感染炭疽病的油茶叶片光谱， 实线表示健康油茶叶片光谱。 在波长251.432和252.285 nm处分别观察到Si和Fe的特征峰， 从图中可以发现健康油茶叶片中Si的特征峰强度明显大于感染炭疽病油茶叶片中Si的特征峰。 这种差异归因于Si在植物生长过程中所起的作用： Si是油茶生长必需的营养成分， 可以促进植物生长， 提高产量和品质； Si还具有抵抗病原菌侵袭植物的作用。 健康油茶树中大量的Si元素起到抗病作用， 与之相反， 感染炭疽病的油茶叶片中Si含量低， 受炭疽病侵害。

图3是Fe和Mn的LIBS光谱。 短划线表示感染炭疽病的油茶叶片光谱， 实线表示健康油茶叶片的光谱。 观察到Fe和Mn谱线： Fe(Ⅰ)385.991 nm， Fe(Ⅱ)259.837 nm， Mn(Ⅱ)260.568 nm。 从Fe的三个特征峰可以明显的观察到， 健康油茶叶片中Fe的特征峰强度高于感染炭疽病油茶叶片中Fe的特征峰强度。 原因是Fe是形成叶绿素必须的微量元素， 健康油茶叶片中含有的大量Fe作用于细胞呼吸和代谢， 而感染炭疽病的油茶叶片的表面上出现病斑且病斑周围呈淡黄色， 出现缺铁变黄的症状。

图2 油茶叶片在250～254 nm波长范围内Si和Fe的LIBS光谱

图3 油茶叶片的Fe和Mn的LIBS光谱

图4是Mn的LIBS光谱。 短划线表示感染炭疽病的油茶叶片光谱， 实线表示健康油茶叶片的光谱。 从图3和4中可以明显地观察到Mn(Ⅱ)260.568 nm， Mn(Ⅰ)279.482 nm和Mn(Ⅰ)280.108 nm的特征谱线。 同样可以发现健康油茶叶片中Mn的特征峰强度明显大于感染炭疽病油茶叶片中Mn的特征峰强度。 这是因为Mn是叶绿体的组成部分， 是维持叶绿体结构所必需的微量元素， 当叶片严重缺锰时， 叶面会出现黑褐色细小斑点， 并逐渐扩大， 散布于整个叶片。 由感染炭疽病油茶叶片的外观可推断感染炭疽病的油茶叶片缺锰， 所以该叶片中Mn的特征峰强度比较低。

图4 油茶叶片在278～282 nm波长范围内Mn的LIBS光谱

实验过程中， 分别挑选了炭疽病病斑面积占叶片总面积比例不同的LIBS光谱图如图5所示。 A代表炭疽病病斑面积占总面积1/4以下的LIBS光谱， B代表病斑面积占总面积1/4～2/4的LIBS光谱， C代表病斑面积占总面积2/4～3/4的LIBS光谱， D代表病斑面积占总面积3/4以上的LIBS光谱。 从图中可以清晰地发现叶片表面上病斑面积越小其对应的特征峰强度就越大， 其中病斑面积在1/4～2/4和2/4～3/4的LIBS光谱强度差异很小， 很难区分。 但从光谱的总体趋势可以发现叶片LIBS光谱特征峰强度随着病斑面积的增大而减小。

图5 四种炭疽病病斑面积不同的LIBS光谱图

综合上述健康油茶叶片中Si， Fe和Mn的特征峰强度明显高于感染炭疽病的油茶叶片中Si， Fe和Mn的特征峰强度。 且油茶叶片中的微量元素Si， Fe和Mn的LIBS信号强度与叶片的健康状态呈线性关系， LIBS信号强度随着叶片的病害状态加重逐渐降低。 故选用Si(Ⅰ)251.432 nm， Fe(Ⅰ)252.285 nm， Fe(Ⅱ)259.837 nm， Fe(Ⅰ)385.991 nm， Mn(Ⅱ)260.568 nm， Mn(Ⅰ)279.482 nm和Mn(Ⅰ)280.108 nm七条特征光谱对油茶叶片的健康和感染炭疽病的两种情况进行分析。

2.2 健康和染病的油茶叶片LIBS光谱的PCA分析

为了更清晰地区分健康和感染炭疽病的油茶叶片， 选用Si(251.432 nm)， Fe(252.285， 259.837和385.991 nm)， Mn(260.568， 279.482和280.108 nm)的特征峰进行PCA分类。 主成分个数设置为7个， 特征变量选取了七段光谱波段： 251.429 9～251.531 4， 252.241 4～252.342 7， 259.791 3～259.891 3， 385.957 7～386.044 3， 260.540 5～260.640 3， 279.398 2～279.494 3和280.070 1～280.166 0 nm。 由于选取数据的变量维数较多， 为了更好地从图中判别两种叶片光谱的差异性， 建立了三维的PCA分类模型如图6所示， 其中PC1， PC2和PC3的贡献率分别为80%， 12%和6%。 红色圆代表健康油茶叶片， 蓝色三角代表秆染炭疽病的油茶叶片， 从图中可以清晰的观察到PCA分类方法可以很好的对健康和感染炭疽病的油茶叶片进行分类， 其中有少数的叶片光谱区分的不是很明显， 可能原因是感染炭疽病的叶片表面上患病面积较小， 属于患病初期， 微量元素含量变化较小， 与健康油茶叶片中微量元素的含量比较接近。

图6 健康油茶叶片和感染炭疽病的油茶叶片的PCA分析

2.3 基于偏最小二乘的油茶叶片健康状态判别模型研究

使用122个样品用于判别模型建立， 其中健康油茶叶片59个， 感染炭疽病的油茶叶片63个。 首先人为设定健康油茶样品类别为2， 感染炭疽病的油茶样品类别为-2， 然后按照3∶1的比例将油茶叶片随机分为建模集和预测集两部分， 建模集有92个样品(健康叶片43个， 感染炭疽病叶片49个)， 预测集有30个样品(健康叶片16个， 感染炭疽病的14个)。 如图7所示， 在PLS-DA建模集模型中， 误判样品数为4个， 误判率为4.3%； PLS-DA预测集模型中， 误判样品个数为3个， 误判率为10%。 两个判别模型的识别率都高于90%以上， 能够较好的将健康油茶叶片和感染炭疽病的油茶叶片分类。

图7 偏最小二乘判别分析模

3 结 论

分析了油茶叶片中的微量元素Si， Fe和Mn的LIBS信号特点， 得出的结论是： 这三种微量元素的LIBS信号的特征峰强度与油茶叶片感染炭疽病的等级(健康叶片为0级)具有相关性， 随着等级的增加， LIBS信号特征峰强度逐渐降低。 另外， LIBS光谱线结合MSC光谱预处理方法和PCA分类方法对健康和感染炭疽病的油茶叶片进行分类， 可以很好地区分健康油茶叶片和感染炭疽病的油茶叶片。 进一步利用PLS-DA进行建模判别， 模型的识别率均高于90%以上， 也可以较好地区分油茶叶片的健康和染病两种状态。

研究显示， 采用激光诱导击穿光谱技术结合主成分分析、 偏最小二乘判别分析法识别油茶炭疽病叶片具有一定可行性。 为植物样品检测微量元素和营养元素提供了参考， 同时也为LIBS的应用提供了参考。