元素分析-同位素比值质谱法测量海洋沉积物中有机碳和氮稳定同位素组成的实验室间比对研究

常文博， 李凤， 张媛媛， 贺行良

(青岛海洋地质研究所， 山东 青岛 266071)

海洋沉积物处于水圈、生物圈和岩石圈的交汇地带，是有机质沉积和埋藏保存的重要储库，作为生源要素碳、氮的重要源与汇，在其生物地球化学循环中起着至关重要的作用[1]。海洋沉积物等地质样品因具有较复杂的成分，又与淡水沉积物、土壤等大陆情况不同，且独立于海水的水体环境而具有极高的科学研究价值。

有机碳、氮稳定同位素作为一种有效的指标[2-4]，其研究成果已广泛应用于全球碳循环[5-8]、气候变化、生物演化、有机质来源[9-11]与迁移转化、地层对比[12]等海洋生态环境、生物地球化学研究领域。通过测定海洋沉积物中的有机碳、氮稳定同位素值及计算其比值，可以重建来源地的地球环境变化等信息，推测沉积物演变过程[13]。沉积物中有机碳同位素δ13C能够确定有机质的来源，典型海洋浮游植物的δ13C值为-22‰～-19‰，湖相藻类的δ13C值为-30‰～-25‰；陆生C3植物(三碳植物)的δ13C值约为-28‰～-26‰，C4植物的δ13C值约为-16‰～-10‰[14-15]。稳定氮同位素δ15N则被广泛地用来示踪食物链的摄食路径，有机质的源汇，水中脱氮、硝化过程、氮的固定化和富营养化等方面。典型海洋浮游生物的δ15N值范围为4‰～10‰，平均值为6‰，陆源有机质的δ15N值范围为-10‰～10‰，平均值为2‰。

稳定同位素分析技术的运用，首先依赖于同位素组成的高精度与高准确度测定，而同位素标准物质则是同位素组成高准确度测定的根本保证[16]。近年来，在稳定同位素测试分析方面，随着高精度、连续流同位素仪器的引进，我国同位素实验室测试仪器和测试手段得到了迅速普及和发展。目前δ13C和δ15N分析主要采用EA-IRMS 在线技术[17]，具体是把元素分析仪(EA)与稳定同位素比值质谱仪(IRMS)通过一个ConFlo接口连接起来，将样品包裹于锡杯中，放入EA自动进样器，由EA燃烧转化为CO2和N2，通过载气将待测气体带入IRMS进行稳定同位素比值测定，可以实现一步操作即可完成CO2和N2气体的生成和质谱分析，减少了人为因素引起的误差[18]。样品的燃烧、注入参考气体、质谱分析和数据处理均由计算机控制完成，方法高效、准确度高。

目前使用EA-IRMS联用方法测定海洋沉积物中有机碳、氮稳定同位素的报道不多，且主要局限于对比不同前处理方法的异同或前处理方法的条件优化，没有横向对比相同标准物质校准下，仪器测试准确度和精密度之间的差异。除此之外，对于海洋沉积物δ13C、δ15N缺少相应的标准物质和标准方法，现阶段各实验室仅采用各自的工作标准。国际原子能机构(IAEA)、美国地质调查局(USGS)等国外机构研制并定值的有机碳、氮稳定同位素相关的标准物质种类较多，涉及纯品类型标准物质，也包括沉积物、土壤、生物样品等天然基体的同位素参考物质，但价格十分昂贵，不利于在我国实验室的推广。我国海洋地质调查及分析资料积累丰富，各类技术规范中都明确规定了使用标准物质进行样品分析测试质量监控，一段时间以来我国海洋沉积物标准物质定值仅涉及常微量组分，青岛海洋地质研究所针对我国在海洋沉积物碳氮稳定同位素标准物质方面的需求，于2018年研制了三个涵盖我国潮间带、近海、深海等海域沉积物中碳氮稳定同位素标准物质(GBW04701、GBW04702、GBW04703)。基于此，本文对多个实验室使用相同的实验仪器，国家标准物质GBW04701、GBW04702、GBW04703和国际标准物质(EMA-B2152、 EMA-B2151)的δ13C、δ15N进行比对实验，得到较好的精密度，以确定EA-IRMS联用方法测定海洋沉积物中有机碳、氮稳定同位素的适用性并验证标准物质的可靠性。

1 实验部分

1.1 样品的选择

本文选用5个不同有机碳、氮稳定同位素水平范围的实验室间水平测试样品(表1)，其中水平1～水平3是国家一级海洋沉积物碳、氮稳定同位素标准物质GBW04701、GBW04702、GBW04703，它们分别是2012～2013年期间在我国渤海锦州湾湿地(潮间带)、东海闽浙近岸(海岸带)、东海冲绳海槽(深海)三个海域采集得到的表层沉积物，涵盖了“潮间带—海岸带—深海”区域。该系列标准物质由3个不同梯度的同位素比值的样品组成，通过了均匀性和稳定性检验[19-21]，定值信息丰富(包含碳同位素δ13C-TC、δ13C-Corg和氮同位素δ15N-TN、δ15N-Norg)，应用范围广，不仅可用于仪器工作条件的优化与校准，还可对整个实验测试流程进行质量监控与评价[22-23]，是我国第一套以海底沉积物为介质的自然基体型碳、氮稳定同位素标准物质。水平4、水平5是英国元素微量分析公司(Elemental Microanalysis，EMA)研制的土壤、沉积物标准物质(EMA-B2152、 EMA-B2151)。

1.2 测试方法

样品采用真空冷冻干燥后，取0.5g过100目的研磨样品放入聚丙烯离心管中，加入5mL稀盐酸(1.2mol/L)，待剧烈反应结束后，充分摇匀，于通风橱中静置，敞口反应8～12h，期间于旋涡混合仪上混匀2～3次，2000r/min下离心5min后倒出上清液，再加入5mL高纯水对样品进行漩涡混匀并离心，去除上清液，充分操作3～4次，直至上清液接近中性。

将上述酸化好的样品置于-50℃冻干机中冷冻干燥48h，干燥后捣碎、研均，用锡杯紧密包裹置于Flash EA1112型元素分析仪中，炉温950℃，柱温50℃，He流量为300mL/min，氧气注入流量为175mL/min，通氧时间选为3s。在高温富氧条件下瞬间燃烧，所产生的CO2、N2O、NOx等混合气体在高纯氦气的带动下，依次通过Cr2O3、Cu和Co3O4/Ag填料发生氧化还原反应，最终转换成CO2和N2，在载气的带动下，通过连续流接口送入同位素比值质谱仪。IRMS真空度为2.6×10-8kPa，发射电流1.5mA。质谱仪将气体分子电离为不同m/z比值的离子束，测定并记录离子束各组分的强度。测定δ13C时，IRMS监测离子(m/z)为44、45、46，测定δ15N时，IRMS监测离子(m/z)为28、29，并保证样品m/z44和m/z28的信号都大于1000mV。数据处理程序将离子束强度转化为同位素丰度，并将待测样品与标准物质相比较，得到相对于国际标准的碳、氮同位素比值。

经过对行业代表性、实验室技术能力及设备条件等多方面因素进行综合考虑，在我国选择了十家实验室作为协作单位承担此次比对实验工作。通过对测试样品准确度、精密度的研究，评估该方法的适用性。

同位素比值是某一元素的重同位素丰度与之轻同位素丰度的比值，由于自然界中各元素的重同位素丰度远低于轻同位素，国际上通常采用δ来表示样品的同位素比值，δ13C、δ15N的分析计算公式为：

式中：Rsample、Rstandard分别为样品、国际标准物质VPDB中13C与12C和15N与14N的丰度比(13C/12C,15N/14N),δ13C和δ15N的仪器分析精度分别为±0.05%、±0.10%。

2 实验室间准确度和精密度协作实验

各家实验室按照统一的前处理方法[24-25]、实验流程[26-27]、操作方法与测试要求[28]，分别进行了5个水平的协作试验工作，每个样品测定4～6次。协作实验的质量控制按照行业标准《地质矿产实验室测试质量管理规范 第8部分 同位素地质样品分析》(DZ/T 0130.8—2006)执行。协作实验δ13C和δ15N的测定准确度数据见表2。

表2 协作试验δ13C和δ15N测定准确度数据

(续表1)

2.1 δ13C和δ15N值测试结果的准确度

十家实验室对5个平行样品δ13C和δ15N的测试结果与标准值相吻合，各比对样品测量值与标准值之差(准确度)见图1。所有比对样品δ13C的准确度在-0.32‰～0.37‰范围内；δ15N值的准确度在-0.35‰～0.29‰范围内。δ13C值的最大偏差为K实验室的样品，准确度为0.37‰；δ15N值的最大偏差为F实验室的样品，准确度为-0.35‰。

实验结果表明，元素分析-同位素比值质谱法测量δ13C、δ15N同位素的结果稳定，与标准值无明显差异，能够快速、准确地完成样品测试。

2.2 δ13C和δ15N值测试结果的精密度

通过5个水平样品测量结果计算出的精密度统计结果见图2。所有实验室测试的δ13C精密度均好于0.10‰，δ15N精密度好于0.14‰。因此元素分析-同位素比值质谱法测量海洋沉积物有机碳、氮同位素取得数据的准确，精密度较高，能够满足实验室各种测试要求。

3 比对实验数据一致性检验

3.1 曼德尔h-k值检验一致性数理统计

通过检验多个实验室测试结果的一致性，可以保证测试方法的准确性和测试水平的适用性。按照国家标准《测量方法与结果的准确度(正确度与精密度)第2部分 确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法》(GB/T 6379.2—2004)，对各实验室所测数据进行实验室间一致性曼德尔统计量h和k检验。δ13C测定结果的1%的h临界值为±2.18，5%的h临界值为±1.80；1%的k临界值为1.66，5%的k临界值为1.45。δ15N测定结果的1%的h临界值为±2.13，5%的h临界值为±1.78，1%和5%的k临界值分别为1.66、1.45。

曼德尔h、k统计量可以用来描述测量方法的变异，也可以应用到方法再现性评估中(图3)。计算实验室间的一致性统计量h的方法是用单元对平均值的利差除以单元平均值的标准差。h值可正可负，h值越小，表示数据越接近于所有实验室数据的平均值[29]。测试结果显示，十家实验室之间δ13C、δ15N同位素测试水平比较稳定。其中，在δ13C的h统计图中，C实验室的水平1达到5%临界值，δ15N的h统计图中，D实验室的水平5、F实验室的水平3、G实验室的水平1、I实验室的水平2接近或达到临界值，除极少数结果超过1%临界值，其他都在1%临界值以内，说明整体比较稳定；计算实验室内一致性统计量k的方法是先对每个水平计算联合单元内标准差，然后对每个实验室的每个水平内计算。k值表示实验室内样品中各个水平测试数据结果在整体平均值上分布基本都在显著性水平1%曼德尔临界值之内。其中，在δ13C的k统计图中，B实验室的水平2、D实验室的水平3、G实验室的水平4、5、H实验室的水平5达到或接近临界值；在δ15N的k统计图中，A实验室的水平4、C实验室的水平2、E实验室的水平3、G实验室的水平5接近或达到临界值，除极少数结果超过1%临界值，其他都在1%临界值以内，说明整体比较稳定。δ13C、δ15N实验室内重复性基本都能控制在显著性水平1%曼德尔临界值之内，因此元素分析-同位素比值质谱法在不同实验室重复性和再现性整体良好。

图1 不同实验室测试δ13C和δ15N的准确度(A～J为参与比对测试的实验室代码)Fig.1 Accuracy of δ13C and δ15N in different laboratories (A-J is the laboratory code that participated in the comparison test)

图2 不同实验室测试δ13C和δ15N的精密度(A～J为参与比对测试的实验室代码)Fig.2 Precision of δ13C and δ15N in different laboratories (A-J is the laboratory code that participated in the comparison test)

图3 实验室间比对δ13C和δ15N曼德尔h-k统计图Fig.3 Mandel h-k value statisticalFigures of δ13C and δ15N in inter-laboratory

3.2 离群值的检验

对离群值的检验方法有柯克伦(Cochran)检验和格拉布斯(Grubbs)检验。柯克伦检验是对实验室内变异的检验，格拉布斯检验主要是对实验室间变异的检验。如果检验统计量小于或等于5%临界值，则接受被检验项目为正确值；如果检验统计量大于5%临界值，但小于等于1%临界值，则称被检验的项目为歧离值，用单星号(*)标出；如果检验统计量大于1%临界值，则称被检验的项目为离群值，用双星号(**)标出。

3.3 重复性和再现性统计结果

比对数据的一致性体现在方法的重复性和各个实验室的再现性，参与比对的实验室之间再现性试验获得的实验数据精密度应遵循一定的数值数理统计，在多个水平测试下的实验数据，除了需要对这些数据的精密度、准确度、重复性、再现性进行估计，还需要对这些实验数据进行考察。J实验室在δ15N测试中未能得到合理的结果，排除J实验室对统计结果的影响，不参与统计。

按GB/T 6379.2—2004规定的方法，利用5个不同水平的试样，在9～10家实验室进行了方法精密度试验。在剔除离群值后，得到方法重复性和再现性的统计数据见表3。从测量的本质和计算拟合的结果可知，重复性(r)和再现性(R)与m值的变化结果较微弱。因此，十家实验室测试结果的重复性和再现性良好[30]。

表3 δ13C和δ15N测定的重复性与再现性统计结果

3.4 测量方法正确度计算结果

按照国家标准《测量方法与结果的准确度(正确度与精密度) 第4部分：确定标准测量方法正确度的基本方法》(GB/T 6379.4—2006)规定的方法，利用5个不同水平的试样，在9～10家实验室进行了方法正确度试验，得到方法偏倚统计数据见表4。多个实验室和多组样品参与协作比对实验时，实验室的偏倚量可以有效地评价每个实验室对每个样品测试的偏倚情况。在95%的置信水平下，实验室偏倚范围就是每个实验室对特定样品测试值与该样品标准值相比偏倚程度和偏倚方向。其中偏倚区间[δ-A×SR,δ+A×SR]包含0，则实验室偏倚不显著，否则偏倚显著。测试结果表明，δ13C测试中的EMA-B2151的δ+A×SR测试结果相对于标准值偏负，其余样品都获得了较好结果。

4 结论

本文通过对多家实验室开展比对实验，用元素分析-同位素比值质谱法测定不同海洋沉积物样品有机碳、氮稳定同位素比值，测得的δ13C和δ15N精密度分别好于0.10‰、0.14‰。该方法的精密度和准确度良好，比对实验采用的方法的重复性和再现性可靠，比对方法稳定，验证了元素分析-同位素比值质谱法在海洋沉积物有机碳、氮稳定同位素测试方面的适用性。

随着同位素质谱方法的不断完善和推广，迫切需要开展标准化工作，海洋沉积物标准分析方法的建立与完善，有利于测试技术的标准化、规范化、科学化。本研究验证了三种国家标准物质(GBW04701、GBW04702、GBW04703)的可靠性，为后续元素分析-同位素比值质谱法测定海洋沉积物中有机碳、氮稳定同位素的方法比对工作补充了资料和奠定基础。这三个标准物质为我国不同海域的海洋沉积物样品，种类丰富，沉积环境多样，但δ13C和δ15N数值范围较小，在进行质量控制工作时可控范围较小，还需要更多标准物质研制工作的推进。

表4 δ13C和δ15N测量方法偏倚的估计