文凌云,徐祥林,赵 冬,孙 卉,陈艳萍,柏羽纯,何志贵*
(1.桂林旅游学院 休闲与健康学院,广西 桂林541006;2.广西桂林锐德检测认证技术有限公司,广西 桂林541100)
柠檬(Citrus limon(L.)Burm.f.)为芸香科柑橘属植物,又称柠果、洋柠檬、益母果等,不仅含有丰富的柠檬酸,而且含有丰富的营养物质,如类黄酮、维生素C、维生素A、维生素E以及Ca、Fe、Zn等多种微量元素,因而具有极高的营养价值和药用价值[1]。柠檬亦被誉为保健水果,可降低胆固醇、预防高血压、心脏病、心血管硬化、口腔溃疡、坏血病、防止结石[2-4]。用柠檬汁酿造的柠檬酒,不仅可保留柠檬原有的特殊香味,且口感良好、营养丰富[3]。柠檬酒的制作与生产已成为柠檬加工产业的重要途径[5-6]。
目前,国内对柠檬酒的研究主要集中在其发酵工艺的优化[1,4,7-9]、发酵菌株的筛选[5]、降酸工艺[6]和澄清工艺等方面[3]。国外研究主要集中于柠檬的挥发性成分及其生物活性[10-12]以及柠檬的功效[13]等方面。针对柠檬酒的挥发性香味物质的研究极少,并且挥发性物质成分及含量是柠檬酒品质和安全的重要指标之一[14]。
因此,本研究采用定量描述性感官评价法对柠檬发酵酒与蒸馏酒进行感官评定,参照相关国标方法对其主要理化指标(总酸、还原糖、可溶性固形物含量)进行检测,并采用气相色谱-质谱(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)联用技术对其挥发性风味成分进行分析,以期为提高柠檬酒的品质和安全提供参考依据。
1.1.1 样品柠檬蒸馏酒和柠檬发酵酒:中国科学院广西植物研究所植物功能物质研究与利用重点实验室。
1.1.2 主要试剂二氯甲烷(色谱纯)、无水硫酸钠、邻苯二甲酸氢钾、氢氧化钠、酚酞(指示剂)、盐酸、五水硫酸铜、酒石酸钾钠、亚铁氰化钾、乙酸锌、冰乙酸(均为分析纯):西陇科学股份有限公司;亚甲蓝(指示剂):国药集团化学试剂有限公司;葡萄糖标准品(纯度≥99%):成都西亚试剂有限公司。
WYA-2S数字阿贝折射仪:上海精密科学仪器有限公司;Agilent7890B-7000C气相色谱质谱仪:美国Agilent公司。
1.3.1 柠檬酒感官评价
参考牛云蔚等[15-16]的方法进行感官评价,并进行一定改良。选取10点制,0~9分(0分=没味道,9分=味道最强)。评价小组由10人(5男,5女,年龄在23~30岁之间)组成。评价人员根据相关标准进行培训,分别对柠檬蒸馏酒和发酵酒的4种感官属性(酸、甜、苦、涩)进行评价,每个样品重复评价3次。
1.3.2 柠檬酒理化指标测定
参照GB/T 12456—2008《食品中总酸的测定》中的滴定法测定总酸含量;参照GB 5009.7—2016《食品安全国家标准食品中还原糖的测定》中的直接滴定法测定还原糖含量;参照GB/T 12143—2008《饮料通用分析方法》中的折光计法测定可溶性固形物含量。以上理化指标均重复测定3次。
1.3.3 柠檬酒挥发性成分分析
准确量取100 mL样品置于分液漏斗中,加入等量二氯甲烷,摇匀,萃取,静置分层后,放出下层萃取液,重复萃取3次,合并3次萃取液,用无水硫酸钠除去多余水分,采用浓缩仪浓缩至1 mL后,将其定容至5 mL,并用0.22 μm的有机滤膜过滤,采用GC-MS分析挥发性成分[17]。
气相条件:HP-5MS弹性石英毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm),进样口温度250 ℃,分流比20∶1,流速1.2 mL/min,进样量1 μL。程序升温:初始60 ℃维持5 min,再以5 ℃/min升至240 ℃保持30 min,后运行260 ℃维持3 min。
质谱条件:电子电离(electron ionization,EI)源,离子源温度为250 ℃,电子能量为70 eV,溶剂延迟时间3.5 min,全扫描模式。
定性定量分析:使用工作站软件NIST MS进行数据处理,运用NIST 14谱库与样品色谱峰进行比对分析,并结合保留指数(retention index,RI)进行定性分析。采用面积归一化法进行定量分析,确定各挥发性物质的相对含量。
1.3.4 数据处理
所有实验数据均重复测定3次,所得结果用“平均值±标准偏差”表示。实验数据采用Excel和SAS 9.3统计软件进方差分析和差异显著性分析,显著性水平取P<0.05。
感官属性(酸、甜、苦、涩)可以较好的解释酒的口感和味道特征。品评人员主要从酸、甜、苦、涩4个属性对柠檬发酵酒和蒸馏酒的感官特征进行描述,结果见表1。由表1可知,柠檬发酵酒中酸味值(5.167分)最高,甜味值(2.267分)最低,苦味值(3.733分)和涩味值(3.567分)居中。而柠檬蒸馏酒中涩味值(5.267分)最高,甜味值(2.633分)最低,苦味值(4.967分)和酸味值(4.067分)居中。两种酒样除涩味存在显著差异外(P<0.05),其他3种属性均无显著差异(P>0.05)。这表明这两种酒的口感差别主要是由涩味属性引起的。
表1 柠檬酒感官评定结果Table 1 Results of sensory evaluation of lemon wine
对柠檬发酵酒和柠檬蒸馏酒的总酸含量、还原糖含量及可溶性固形物含量进行测定,结果见表2。由表2可知,柠檬发酵酒中,总酸含量为6.78 mg/mL,可溶性固形物含量为6.07%,还原糖含量0.16 mg/mL,柠檬蒸馏酒中,总酸含量为0.18 mg/mL,可溶性固形物含量为19.3%,还原糖含量0.07 mg/mL。两种酒样在总酸含量、还原糖含量以及可溶性固形物含量具有明显的差异性(P<0.05)。
表2 柠檬酒的理化指标Table 2 Physicochemical indicators of lemon wine
2.3.1 柠檬发酵酒与蒸馏酒挥发性风味化合物种类及相对含量的差异
由表3可知,通过GC-MS联用技术从柠檬发酵酒中共检测出40种挥发性化合物,其中酯类物质种类最高,为20种;其次是醇类和酸类化合物,均为9种;醛类化合物种类最少,仅为2种。4类挥发性化合物的相对含量为酯类(53.63%)>醇类(27.48%)>酸类(12.93%)>醛类(5.96%)。由表4可知,柠檬蒸馏酒中共检出33种挥发性化合物,其中酯类物质种类数量最多(15种),其次为醇类化合物(5种)、酸类化合物(4种)、杂环类(3种)和烷烃类(3种),烯类(2种)和醛类(1种)较少。7类挥发性化合物的相对含量为酯类(48.43%)>烯类(27.78%)>醇类(14.74%)>酸类(4.19%)>烷烃类(2.71%)>杂环类(1.86%)>醛类(0.29%)。两种柠檬酒挥发性化合物中,酯类化合物的种类和相对含量均最高,醛类化合物含量均最低。
表3 柠檬发酵酒中挥发性风味化合物组成及相对含量Table 3 Components and relative content of volatile flavor compounds in fermented lemon wine
表4 柠檬蒸馏酒中挥发性风味化合物组成及相对含量Table 4 Components and relative content of volatile flavor compounds in distilled lemon spirit
续表
2.3.2 酯类化合物比较
两种柠檬酒中酯类化合物的相对含量均最高。柠檬发酵酒中酯类化合物有20种(相对含量为53.63%),主要包括辛酸乙酯、琥珀酸单乙酯、α-乙酸松油酯、9-十六碳烯酸乙酯等;柠檬蒸馏酒中酯类化合物有15种(相对含量为48.43%),主要包括辛酸乙酯、癸酸乙酯、9-十六碳烯酸乙酯、月桂酸乙酯、十六酸乙酯等。两种柠檬酒中的酯类化合物均以辛酸乙酯相对含量最高,分别为21.74%和25.14%。辛酸乙酯是具有梨子香味的挥发性化合物[18]。两种柠檬酒的其他成分差异较大,可能是构成二者香味差异的重要原因。
酯类化合物是酒体中最活跃的成分,是果酒整体香气形成的重要组成部分。酯类物质大多赋予果酒水果香气,如辛酸乙酯、己酸乙酯、乙酸异戊酯、柠檬酸三乙酯、月桂酸乙酯、癸酸乙酯均具有类似水果香味的香气,可使酒变得香醇清甜[18],是柠檬发酵酒香味的重要来源。
2.3.3 醇类化合物比较
柠檬发酵酒中的醇类物质所占比例仅次于酯类物质,相对含量为27.48%,共检测出9种;而柠檬蒸馏酒中醇类化合物相对含量为14.74%,共检测出5种。醇类化合物是果酒重要的芳香组分,高级醇类物质主要是微生物通过降解代谢途径(Ehrlich代谢机制)和合成代谢途径(Harris代谢机制),通过相应α-酮酸的脱羧作用与加氢还原而实现的[19]。醇类化合物可使果酒香气浓厚丰满,同时也是形成酯类化合物的前体物质,主要呈现清香和青鲜香气[20-21]。两种柠檬酒的醇类物质中的对羟基苯乙醇、苯乙醇相对含量均较高,并均检测出α-松油醇。苯乙醇是酵母菌发酵的特有产物,本身也具有玫瑰香气[21];α-松油醇有持久的紫丁香香气,对柠檬酒香气的形成具有积极作用[23]。其他醇类化合物,除了异蒲勒醇具有樟脑和薄荷香气外,其余均无明显的香气,但它们也是构成柠檬酒的重要组成成分。
2.3.4 酸类化合物比较
酸类化合物主要是有机酸,其含量的高低对果酒的感官品质有较大影响[24]。柠檬发酵酒中共检测到酸类化合物9种,相对含量为12.93%,主要包括4-酮庚乙酸、肉豆蔻酸、(S)-(+)-柠苹酸、L-苹果酸、4-羟基苯基-甘氨酸、油酸、丁酸、7-辛烯酸、对羟基肉桂酸。柠檬蒸馏酒中共检测到酸类化合物4种,相对含量为4.19%,主要包括正癸酸、肉豆蔻酸、月桂酸、缬草酸。虽然酸类化合物的呈香贡献较小,但可以协调果酒的口感等作用[25]。
2.3.5 其他类化合物比较
柠檬发酵酒和蒸馏酒中醛类物质相对含量分别为5.96%、0.29%,相对含量均最低。柠檬发酵酒中检测到的醛类化合物主要是丙醛二乙基乙缩醛和3-乙氧基-4-丙氧基苯甲醛;柠檬蒸馏酒中检测到的醛类化合物是对甲基苯甲醛。虽然挥发性醛类化合物在柠檬酒中的含量有限,但是也对其香气特征做出了重要的贡献[26]。此外,在柠檬蒸馏酒中检测到烷烃类、烯类和杂环类物质。其中烷烃类物质包括1,1,2,2-四氯乙烷、2,2-二甲基辛烷、2,6,11-三甲基十二烷;烯类物质包括D-柠檬烯、β-石竹烯和3-甲基-6-(1-甲基乙亚基)环己烯;杂环类物质包括1-(7-氧杂双环[4.1.0]庚-1-基)乙酮和3,2',4'-三羟基-4-甲氧基查耳酮。烯类物质在柠檬蒸馏酒中的相对含量仅次于酯类物质,其中D-柠檬烯相对含量为22.15%。D-柠檬烯又称苧烯,是一种环状单萜烯,具有较强的令人愉悦的柠檬样香气但留香时间很短。
通过定量描述性感官评价法对柠檬发酵酒和蒸馏酒进行感官评定发现,2种柠檬酒样除涩味存在显著差异外(P<0.05),其他3种属性均无显著差异(P>0.05),均以苦、涩、酸味为主,甜味评分最低。通过理化指标检测发现,2种柠檬酒的总酸、还原糖和可溶性固形物含量都具有显著性差异(P<0.05)。采用GC-MS技术对其挥发性物质组分分析发现,从柠檬发酵酒与蒸馏酒中分别检测出40种、33种挥发性风味物质,且均以酯类物质种类(20种、15种)及相对含量(53.63%、48.43%)最高,与柠檬发酵酒相比,除检测到酯类、醇类、酸类、醛类物质外,柠檬蒸馏酒中还检测到烷烃类、杂环类及烯类物质。