发酵型果酒中甲醇和杂醇油的研究进展

张 香，秦 丹，曾 璐，陈长松

（1.湖南农业大学 食品科学技术学院，湖南 长沙410128；2.湖南农业大学 食品科学与生物技术湖南省重点实验室，

湖南 长沙410128；3.湖南农业大学 园艺园林学院，湖南 长沙410128；4.天下果业开发有限公司，湖南 湘西自治州416000）

果酒是以水果为原料经发酵及一系列工艺处理得到的低酒精度饮料酒[1]。由于原料或生产环节的影响，果酒酿制过程中不可避免有甲醇、杂醇油产生，它们摄入过量会对人体健康构成威胁[2]。因此世界各国都对此进行了限定，欧盟标准规定，以水果为原料的蒸馏酒的甲醇含量应小于4.00 g/L（以酒精度40%vol计算），美国对此的标准是甲醇含量应小于2.80 g/L[3]。我国对果酒中甲醇含量的限定也非常严格，国标GB 15037—2006《葡萄酒》规定红葡萄酒中甲醇含量≤400 mg/L，白、桃红葡萄酒中甲醇含量≤250 mg/L，但目前我国对其他水果酿造的发酵酒的甲醇含量尚无明确规定，主要参考葡萄酒标准。适量的杂醇油虽然可以衬托酯香，增强果酒的风味，但过量则不仅导致果酒产生邪杂味，而且对人体神经系统有毒害作用，是导致“上头”的主要因素之一[4]，因此在酿造过程中对甲醇和杂醇油含量进行调控，对提升果酒的品质和安全性具有重要意义。

1 甲醇及杂醇油对人体的危害

甲醇是果酒酿造过程中极易生成的副产物，有研究表明，人一旦摄入5 g就会出现严重中毒，超过12.5 g就可能导致死亡[5]。其毒性体现在对中枢神经系统有麻醉作用，且在体内不易排出而发生蓄积。另外在脱氢酶作用下，甲醇可被转化为甲醛、甲酸，对氧化酶系统产生抑制，使需氧代谢受阻，使乳酸及其他有机酸发生堆积，引起机体代谢性酸中毒；同时，甲醇对眼组织毒害较大，甲醇及其代谢物甲醛、甲酸在眼房水和眼组织内含量较高时，可引发视网膜代谢障碍，造成视网膜细胞、视神经损害及视神经脱髓鞘[6]。基于上述原因，在发酵酒生产中严格控制甲醇含量成为必然。

杂醇油是具有三个及以上碳原子的一元醇类脂肪醇混合物的俗称，果酒中的杂醇油主要是丙醇、丁醇、异丁醇、戊醇、异戊醇等。杂醇油是原料中的蛋白质水解成氨基酸，再经酵母或糖化菌分泌的脱羧酶和脱氨基酶作用而生成，它还能与有机酸发生酯化反应，生成酯类物质使酒体丰满，故是果酒中重要的呈味物质和芳香物质。但杂醇油含量过高时，不但起不到呈香、呈味的作用，反而会使酒体苦、涩、冲、辣，有令人有不愉快的异杂味，失去原有风格[7]。同时，杂醇油过量摄入对人体有毒害作用，它能令饮用者神经系统充血，且因在人体内代谢慢，停留时间长，使人感觉头痛易醉，也就是常说的“上头”现象[4]。杂醇油类化合物对人体的毒性经研究表明，通常随分子质量的增大而加剧，果酒中以异丁醇和异戊醇的毒性为较大[8]。控制果酒中杂醇油含量是提升果酒品质的重要措施之一。

2 发酵过程中甲醇及杂醇油的生成机理

2.1 甲醇的生成及影响因素

果酒在酿造过程中易产生甲醇，这与原料果胶含量、果胶酶及酵母菌的作用有较大关联，目前其生成机理的研究主要集中在果胶分解代谢和甘氨酸代谢两个途径[9]。

果胶分解代谢途径是指，果胶在果胶酯酶的作用下分解成甲醇和果胶酸（式1），原果胶、果胶酶含量都对甲醇的生成量有影响[10]。YURI L等[11]研究发现，植物细胞壁果胶在果胶酯酶参与下形成甲醇。CABAROGLU T等[12]对100多种葡萄酒样进行了甲醇含量的分析，试验证明了甲醇含量与破碎时果胶的进入有直接的关系。白凤岐[13]通过对比添加果胶组、脱除果胶组、对照组酒中甲醇含量的差异，证明果品果胶含量与其酿造酒的甲醇含量成正比。

此外，果胶酶的种类和添加量都对甲醇的生成有显著影响。刘文等[14]通过比较两个品种桃蒸馏酒中甲醇含量差异性，发现仓方早生和中华寿桃两品种的桃蒸馏酒甲醇含量差异大，主要是与果实中的果胶酶含量、果胶含量相关。姚万欣[15]对不同果胶酶添加量的固态发酵蒸馏梨酒检测其甲醇生成量，发现甲醇生成量与果胶酶添加量呈显著正相关。张卉[16]研究苹果酒甲醇生成的影响因素时发现，果胶酶处理的果泥、果汁和果渣得到的苹果酒的甲醇含量分别比对照组甲醇含量增加了530.06%、668.21%、229.63%（40%乙醇），经方差分析显示均具有有显著差异，说明果胶酶处理对苹果酒的甲醇含量有显著影响。

甘氨酸代谢被认为是甲醇生成的另一主要途径，其作用机理是酵母发酵产酒精的同时，果品中的甘氨酸可在脱氨脱羧酶的作用下直接反应生成甲醇（式2），或是通过甘氨酸裂解酶先分解生成甲胺（式3），再与亚硝酸反应生成甲醇（式4）[15，17]。甘氨酸的浓度与甲醇生成量有密切关系。武晓娜等[17]通过研究酿酒酵母与甘氨酸发酵生成甲醇关系，发现当甘氨酸质量浓度＜0.9 g/L时，与酿酒酵母生成甲醇的量呈线性关系，甘氨酸越多时，产生的甲醇的含量也越多，甘氨酸的转化率达到了24.2%，同时研究还发现，甲醇的产量不仅与甘氨酸相关，而且还与酵母的菌种、发酵工艺的条件相关。

此外，酵母生长代谢情况也间接影响甲醇的生成。姚万欣[15]在固态发酵蒸馏梨酒的研究中发现，随发酵温度的升高和发酵时间的延长，甲醇含量增加。颜雪辉等[18]实验结果发现，随着发酵的温度升高，酵母菌生长旺盛，甲醇含量也较高。这也预示着可能存在与酵母相关的甲醇生成新途径，需要深入研究。

2.2 杂醇油的生成及影响因素

杂醇油是原料中蛋白质、氨基酸和糖类分解形成的高级醇类[19]。目前推断杂醇油的生成途径有两种：一是氨基酸降解代谢路径（Ehrlich代谢机制）[20-21]，即酿酒原料中的氨基酸先通过转氨酶的促进下形成α-酮酸，α-酮酸与脱羧酶进一步反应形成醛，还原生成较氨基酸少一个碳原子的杂醇油。另一种是糖合成代谢路径（Harris代谢机制）[22]，酵母以糖为基质，代谢合成自身必需的氨基酸，其中间体α-酮酸在酶的作用下进行脱羧，后通过还原反应生成相应杂醇油。推断的代谢途径见图1。

图1 杂醇油的代谢途径Fig. 1 Metabolic pathway of fusel oil

目前，国内外对果酒中杂醇油生成的控制主要从可同化氮素和发酵工艺条件两个方面进行调控。可同化氮素是指在酒精发酵中酵母优先利用的氮素，包括游离α-氨基酸、小分子多肽以及铵态氮等[24]。可同化氮素与杂醇油的形成有密切关系，在发酵液中添加可同化氮素会影响发酵产物中杂醇油的含量[25]。据文献报道，添加亮氨酸或异亮氨酸的酵母发酵混合物导致杂醇油的产量增加[26]。TORREA D等[26]通过比较葡萄发酵醪液中添加无机氮和有机氮对葡萄酒的挥发性成分和香气特性，发现铵态氮和有机氮的添加降低了杂醇油的含量。VIDAL E等[27]研究可同化氮源对甘蔗酒中杂醇油的影响，发现向可同化氮素含量低的甘蔗汁中添加铵态氮后发现杂醇油的含量降低。商玉荟[28]通过探究不同种类和浓度的外加氮源对无核荔枝酒品质的影响，发现外加氮源的种类对无核荔枝酒中杂醇油的产生有不同影响。

此外，由于酵母种类和发酵工艺条件能间接调控酵母的杂醇油代谢，因此酵母种类和发酵工艺条件与杂醇油的形成也有密切关系。STAVER M等[29]研究了酿酒酵母菌种对杂醇油生成的影响，结果表明选择适宜的酵母菌种可以明显降低杂醇油的生成量。发酵工艺条件也会影响杂醇油生成。于涛等[30]通过苹果酒中杂醇油生成控制研究，发现酵母接种量增大、磷酸氢二铵添加都会降低苹果酒中杂醇油的含量，发酵醪液糖度增大、pH升高、温度升高都会增大杂醇油的含量。

3 甲醇及杂醇油检测方法的研究

3.1 甲醇检测方法的研究

3.1.1 亚硫酸品红比色法

亚硫酸品红比色法是国标GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》规定为酒精通用试验方法之一，该方法通过高锰酸钾磷酸溶液将甲醇氧化为甲醛，过量的高锰酸钾被草酸还原，所生成的甲醛与亚硫酸品红反应，生成醌式结构的蓝紫色化合物，于波长595 nm处比色测定。牛桂芬[31]通过几种白酒中甲醇含量的测定，发现经过对显色剂品红-亚硫酸试剂的改进，使得标准曲线线性关系得到很大提高，根据标准曲线回归方程计算甲醇浓度，所得中、高标准溶液浓度相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）分别为2.07%和1.34%，均小于5%，表明精密度良好。

亚硫酸品红比色法具有所需仪器和试剂简单，操作简单、成本低等优点，但在测定过程中，常遇到显色不稳定，操作繁琐、费时、工作曲线重现性差和回收率试验不理想等问题。

3.1.2 变色酸比色法

变色酸比色法是国标GB/T 15038—2006规定为酒精通用试验方法之一，该方法对甲醇进行测定，通过高锰酸钾将甲醇氧化成甲醛，过量的高锰酸钾用偏重亚硫酸钠除去，甲醛与变色酸在浓硫酸存在下，先缩合，随之氧化，生成对醌结构的蓝紫色化合物，在波长570 nm处比色测定。孙焕冬等[32]通过优化变色酸比色法测定葡萄酒中甲醇含量的实验条件，得出稳定性良好，准确度高的实验方法，该方法呈较好的线性关系，标准曲线回归方程为Y=15.586X-0.030 5，相关系数R2=0.995 2。

变色酸比色法其测定具有操作简单、成本低的优点，但因其测定过程同时受乙醇纯度、显色剂、显色酸度与时间、温度等多种因素影响，存在重现性较差的缺点，目前应用较少。

3.1.3 气相色谱法

气相色谱法是世界上公认的测定酒中甲醇及杂醇油的方法，其原理是利用不同醇类在氢火焰离子化检测器把各组分的浓度信号转变为电信号后由记录仪或工作站软件记录下来，根据色谱峰保留时间可以定性分析，峰面积或峰高可以进行定量分析[33]。罗玥[34]研究酒中甲醇测定方法，分别对气相色谱直接进样法和顶空进样法测定12种酒中的甲醇含量进行研究和比较，检验结果表明直接进样内标法的检出限为7.5 mg/L，加标回收范围为95%～105%，分析精密度试验结果相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）＜2%，该方法具有结果准确、重复性好的特点。卢鹭滨等[35]通过低甲醇金桔蒸馏酒工艺的探究，发现利用气相色谱法测定的金桔蒸馏酒原酒中甲醇含量，结果准确，重复性好。

气相色谱法可直接分析果酒中甲醇含量，具有精密度高、分离效果好、选择性高、短时间内能进行多次检测等优点，但气相色谱法所需仪器昂贵，检验程序复杂、工作量大且测量过程繁琐费时[41]。

3.1.4 其他测定方法

研究酒中甲醇的测定，除了以上几种方法外，还有红外光谱法、高效液相色谱法、核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）法、折射法[11，36]。刘建学等[37]采用近红外光谱法快速检测基酒中的甲醇含量，建立甲醇的定量分析模型，并对模型进行验证，研究结果表明，所建立的甲醇定量分析模型与常用的气相色谱法预测效果一致，模型的精密度和稳定性良好，可为基酒中甲醇含量的在线快速检测提供方法指导。ZHANG Y L等[38]采用傅里叶变换红外光谱和二维红外相关光谱对不同红葡萄酒的主要成分和不同干红葡萄酒的挥发残渣进行分析。结果表明，红外光谱法是一种直接有效的分析不同红葡萄酒主成分和鉴别不同红葡萄酒的方法。由于仪器价格昂贵、灵敏度不高、操作繁琐、成本高等，这些方法实际价值不大。

3.2 杂醇油检测方法的研究

3.2.1 比色法

杂醇油的测定基于脱水剂浓硫酸存在下生成烯类与芳香醛缩合成有色物质，以比色法测定。张建才等[39]通过研究比色法测定葡萄酒中杂醇油含量的实验条件，该方法呈较好的线性关系，标准曲线回归方程Y=15.586X-0.030 5，相关系数R2=0.995 2，稳定性良好、准确度高。

比色法具有操作简单、成本低等优点，但也存在一些缺陷，如酒中还有很多物质会干扰显色，显色不稳定，实验结果重现性较差，灵敏度低，测定误差大，线性关系不理想等，且此法只能检测酒中杂醇油的总量，不能区分出单个的量。

3.2.2 气相色谱法

原理同甲醇气相色谱分析。迟超逸等[40]通过毛细管气相色谱法测定不同陈酿容器贮存红枣白兰地中甲醇、杂醇油含量，建立了一种利用毛细管气相色谱法同时测定红枣白兰地中的甲醇、杂醇油的测定方法，该方法快速、准确、操作简单。结果表明，方法的RSD≤0.34%，样品的加标回收范围为97.56%～102.48%，该法具有较高准确度和精密度。孟雄飞等[41]通过气相色谱法同时测定酒中的甲醇、正丙醇、异丁醇、异戊醇等10种成分，结果显示酒样中甲醇、正丙醇、异丁醇、异戊醇等10种物质的检出限达3 mg/L，相关系数均在0.999 0以上，该方法的精密度试验结果RSD在2.2%～9.9%之间，加标回收率范围为82.3%～118.6%，该法具有较高的准确度和精密度，所得结果可靠。

目前气相色谱法对酒中的杂醇油进行测定相对繁琐，耗时较长，且蒸馏过程中沸点低的杂醇油容易挥发损失。

3.2.3 光谱分析法

光谱分析法是将近红外光谱技术与区间偏最小二乘法结合，筛选最优近红外波长区间，建立杂醇油含量的预测模型。吴同等[42]利用该方法筛选出定量酒中杂醇油含量的最优波长区间，获得了预测能力优于全谱偏最小二乘的校正模型，并在独立的测试集上进行了系统验证。该方法具有快速预测、预测性高、简便快捷低成本无污染以及不破坏样品等优点。但因模型构建，样品需要量大，且对样品状态、测试方式、测试条件都有较严格要求，获取不易，同时还存在分析软件操作复杂等原因，极大的限制了该方法的应用。

4 结论与展望

甲醇和杂醇油是果酒酿造的常见副产物，而饮用甲醇及杂醇油含量过高的果酒可对人体造成毒害，是评价果酒品质的重要考量因素，因此，对其生成量进行调控是果酒研究不可忽略的部分，对果酒规模化、产业化生产有重要意义。本文对果酒中甲醇与杂醇油的生成机理、调控因素及检测方法进行了综述。目前果酒中甲醇、杂醇油的形成机理及相互关系在具体的果酒原料、发酵条件下，甲醇、杂醇油变化规律的研究还需进一步深入。且当前果酒的相关研究仍多以葡萄酒为主，因此在进行特定原料的果酒酿造过程中，还需从原料组分、发酵工艺入手选择适宜的试验和检测方法。现在甲醇及杂醇油的检测多为分别检测且方法单一、操作繁琐，因此在不同原料果酒中同步检测甲醇及杂醇油的方法尚待摸索和确立。