西藏大花黄牡丹籽油的提取及品质评价

钟政昌 张超奇 仁增白玛兰小中阚金涛袁 雷

(西藏农牧学院食品科学学院1，林芝 860000) (西藏森林资源天然产物研究中心2，林芝 860000) (西藏农牧学院理化分析与生物技术中心3，林芝 860000)

大花黄牡丹(Paeonialudlowii)于1997年确立其分类学上的名称[1]，为毛茛科芍药属落叶花灌木, 黄牡丹的一个亚种，为西藏特有植物，仅分布在海拔2 900～3 200 m 的雅鲁藏布江藏布峡谷长约100 km的狭小范围内，是我国8个牡丹种之一[2-4]。李嘉珏等[2]经调查研究认为大花黄牡丹与黄牡丹存在较大差异，大花黄牡丹应该上升为种的等级。大花黄牡丹分布区面积不足10 km2，数量仅有6 000～7 000丛(株)，处于极度濒危状态, 被《中国物种红色名录》收录[5,6]。大花黄牡丹资源数量极少，研究主要集中在资源保护、扩繁栽培等工作[7-11]。近十年来，西藏植物学和藏药资源学工作者、地方政府、地方企业联合大力推动了大花黄牡丹扩繁工作，未来其资源量有望大幅提高。开展大花黄牡丹可持续性的开发利用研究，对服务地方经济及资源保护均有积极意义。

牡丹籽油富含α-亚麻酸,具有多种保健功能，近年掀起了研究热潮[12-16]。2011年世界粮农组织正式批准牡丹籽油列入食用油行列, 同年, 我国原卫生部批准牡丹籽油为新资源食品, 2012年我国农业部粮农所把牡丹籽油列入食用油行列。目前国内外学者对牡丹籽油的研究主要为提取工艺、理化性质评价、脂肪酸分析、部分功效评价、油脂热变性等[17-21],对大花黄牡丹籽油的研究极少，曾秀丽等[22]对西藏林芝和山南地区5个居群的混合种子以及2个居群的单株进行了5种脂肪酸含量分析，而大花黄牡丹籽含油量、提油技术、油脂品质评价等方面鲜有报道。本研究根据GB/T 14488.1—2008测定大花黄牡丹籽含油量，建立提油技术并评价油脂品质，为后期开发利用西藏大花黄牡丹提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

牡丹籽采自西藏林芝县、米林县等地，经兰小中教授鉴定为西藏大花黄牡丹的种子；脂肪酸甲酯系列标准品、α、β、γ、δ-生育酚标准品、甾醇标准品、角鲨烯标准品均为色谱纯，石油醚、正己烷、氯仿、无水乙醚、氢氧化钾、乙醇溶液、酚酞、盐酸、韦氏试剂、碘化钾、冰乙酸均为分析纯。

RH-400KDE超声波清洗器，LYNX4000高速离心机，GJ881-4电热烘干箱，Sap分析天平，R-1001VN旋转蒸发器，Trace GC Ultra—DSQⅡ气相色谱质谱联用仪。

1.2 方法

1.2.1 大花黄牡丹籽含油量的测定

按GB/T 14488.1—2008《植物油料含油量测定》方法测定。黄牡丹籽粒在烘箱中55 ℃烘干48 h至水分为(8.60±0.51)%，以剥壳前后粉碎至20～40目的牡丹籽(仁)粉为原料，精确称取10.000 g样品，用经脱脂处理过的滤纸包好，放入索氏抽提器中，分别以石油醚和正己烷为提取溶剂，在抽提时间为1、2、3、4、5 h测定含油量。

1.2.2 大花黄牡丹籽油的提取

称取15.000 g 大花牡丹籽仁粉末于圆底烧瓶中，按一定比例加入正己烷，置于超声波清洗器中提取一定时间。抽滤，用旋转蒸发仪除滤液中的正己烷，55 ℃下减压干燥剩余物至恒重，准确称重，按公式计算大花黄牡丹籽油的提取率。

式中：M1为接收瓶和大花黄牡丹籽毛油的总质量/g;M2为接收瓶的质量/g；M为大花黄牡丹籽仁粉末质量/g。

1.2.3 提取工艺的优化

单因素实验：设定超声温度50 ℃、超声功率120 W、样品粒度40目、液料比8 mL/g，考察超声提取时间10、20、30、40、50 min对出油率的影响；设定超声提取时间40 min、超声功率120 W、样品粒度40目、 液料比8 mL/g，考察超声温度30、40、50、60、70 ℃对出油率的影响；设定超声温度50 ℃、超声提取时间40 min，样品粒度40目、液料比8 mL/g，考察超声功率40、80、120、160、200 W对出油率的影响； 设定超声温度50 ℃、超声提取时间40 min、超声功率120 W、样品粒度40目， 考察液料比4、8、12、16、20 mL/g对出油率的影响；设定超声温度50 ℃、超声提取时间40 min、超声功率120 W、液料比8 mL/g，考察粒度40、60、80、100、120目对出油率的影响。

正交设计：前期实验表明，超声提取时间、提取温度、超声波功率、液料比、样品粒度大小对出油率均有不同程度的影响。为了减少实验次数，并考察各因素之间交互作用对出油率的影响，拟采用L16(215)正交表进行实验设计，见表1。在前期实验中，观察到超声提取时间与液料比(AE)、超声提取时间与样品粒度(BD)、超声波功率与液料比(CE)的相互作用很小，因此设置为空列。

表1 L16(215)正交设计

1.2.4 理化指标测定

碘价：参照GB/T 5009.299—2016《食品安全国家标准 食品中碘价的测定》；皂化值：参照GB/T 5534—2008《食品安全国家标准 食品中皂化值的测定》；过氧化值：参照GB/T 5009.227—2016 《食品安全国家标准 食品过氧化值的测定》；参照GB/T 5009.229—2016《食品安全国家标准 食品中酸价的测定》；折光指数：用阿贝折光仪测定。

1.2.5 大花黄牡丹籽油微量活性物质分析

生育酚的测定参照GB 5009.82—2016 《食品安全国家标准 食品中维生素 A、D、E 的测定》中维生素E测定方法进行；甾醇测定参照 GB/T 25223—2010；角鲨烯测定参照SNT 4785—2017中的气相色谱-质谱法。

1.2.6 大花黄牡丹籽油脂肪酸分析

脂肪酸的甲酯化：称取样品0.5 g置于50 mL离心管，加入5 mL正己烷、15mL 10%乙酰氯-甲醇溶液，瓶口封死，在80 ℃水浴反应2 h，每隔20 min振摇1次，取出冷却室温，加入6%碳酸钠10 mL，再加入5 mL正己烷，振荡30 min，取出上清液过0.22 μm滤膜，浓度过高时再稀释100倍后待测。

气相色谱条件：色谱柱：HP-wax，30 m×0.25 mm，0.25 μm；进样口温度：270 ℃；程序升温：初始柱温40 ℃，保持1 min，以7 ℃/min升温至210 ℃，保持 5 min，再以1.5 ℃/min升温至240 ℃；载气：高纯氦(纯度>99.999%)，流速：1.0 mL/min；进样方式：不分流进样；进样量：1 μL。

质谱条件：电离方式为电子轰击电离源(EI)；电离能量：70 eV；传输线温度：280 ℃；离子源温度：230 ℃；溶剂延迟：5 min；扫描方式：离子扫描(SIM)。

1.3 数据统计与分析

应用正交设计助手II3.11作正交实验设计，并进行极差分析、方差分析和差异显著性分析(P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著)；应用SPSS18.0 软件计算标准误、单因素差异显著性分析；应用Origin8.0绘制图表。

2 结果与分析

2.1 大花黄牡丹籽含油量

由图1可知，在1～3 h内所有样品的出油率明显增加，石油醚的提油速度比正己烷快，3 h后2种溶剂的提油率无显著差异(P>0.05)，5 h后2种溶剂的提油率基本一致。以5 h作为提取终点，以2种溶剂提油率作综合计算，去壳样品出油率为(39.51±1.04)%，带壳样品出油率为(28.26±1.22)%，此结果视为大花黄牡丹籽的含油量。去壳样品与带壳样品之间出油率差异极显著(P<0.01)，可能是果壳中部分脂溶性色素物质溶出，使得带壳样品的油脂颜色明显比去壳样品的深。基于操作安全性考虑，后期实验选择正己烷作为提取溶剂。

图1 提取溶剂和时间对大花黄牡丹籽出油率的影响

2.2 各因素对大花黄牡丹籽油提取率的影响

提高提取温度可加剧溶剂和油脂的分子热运动，提高扩散速率，从而提高出油率。由图2 可知，在50 ℃时出油率达到最大值。处理温度过高，正己烷挥发加剧，反而减少了正己烷与样品的接触面积，降低了扩散速率[23]，大花黄牡丹籽出油率反而下降。结果表明，50 ℃为适当的提取温度。

图2 大花黄牡丹籽油单因素提取实验结果

不同超声提取时间对大花黄牡丹籽提油率的影响如图2，在10～50 min内，提油率随超声提取时间的增加而增加。超声处理40 min 时出油率为37.10%，50 min时出油率为37.71%，两者差异不明显，原因是油脂在提取液和物料中的浓度达到了动态平衡，其出油率基本稳定[24]。因此，最适超声提取时间为40 min。

超声波功率越大，其产生的机械作用和空化作用越剧烈，油脂渗透出来的速度就越快[25]。当超声功率过大，可能引起自由基降解脂肪酸组分，导致出油率增加缓慢甚至下降[26]。由图2 可知，超声波功率160 W时出油率最高。

减小原料的粒径有利于提高植物油的提取率，油料破碎不完全时细胞结构未被破坏，提取溶剂无法与完整细胞中的油接触而不能充分地将细胞中的油提取出来[27]。粉碎粒度过小，原料的堆积密度增大，溶剂的扩散阻力增大，提取率反而下降[28]，图2表明，样品粒度为100目时提油率最高。

有效浓度差是油脂提取的主要推动力，因此大花黄牡丹籽出油率随着液料比的增大而增加，液料比大于12 mL/g时，出油率的增加缓慢，再增大液料比对大花黄牡丹籽出油率的影响不明显。可能是大花黄牡丹籽中油脂含量逐渐减少，有效浓度差小，再增加溶剂用量的作用甚微[25]。

2.3 正交优化实验结果

2.3.1 正交实验因素水平

在单因素实验的基础上，确定正交实验各因素的水平如表2所示。

表2 正交实验因素水平表

表3 L16(215)正交实验结果

2.3.2 正交实验结果与分析

由表3可知，根据R值大小可判断出各因素和交互项对出油率的影响主次顺序为：E→ED→BE→B=D→AC→BC→A=AB→AD→CD→C。E2>E1，E因素应选E2；BE、ED交互作R值大于B、D项，B、D水平的选择由BE、ED交互项决定,AC交互项R值分别大于A、C，A、C水平的选择由AC决定，由表4和表5可知，应选D2、A2、C2；表4中，在选择E2的条件下，B1E2水平虽比B2E2水平略大，但比表3中B项中B2水平小，因此B因素应B2水平。各因素对提油率最优组合为：A2B2C2D2E2,即处理温度60 ℃、超声提取时间50 min、超声功率160 W、样品粒度100目、液料比12 mL/g。

表4 AC、ED、EB二元表

2.3.3 优化实验验证

以2.3.2得到的优化组合，即处理温度60 ℃、超声提取时间50 min、超声功率160 W、样品粒度100目、液料比12 mL/g，进行3次实验，提油率为(38.24±0.63)%，优于正交设计的结果。

2.4 大花黄牡丹籽的理化性质

由表6可知，正已烷与石油醚提取的大花黄牡丹籽油的碘价、酸价、皂化价、过氧化值差异不显著(P>0.05)，碘值的高低与油脂中不饱和双键的多少有关，双键的数目越多碘值就越高，说明大花黄牡丹籽油不饱和程度大，对人体的健康较有利；酸价是一种脂肪中游离脂肪酸含量的指标，酸价越小，说明油脂质量越好，这一特性将有利于大花黄牡丹籽油后期的精炼工艺；皂化值表示油脂中脂肪酸相对分子质量的大小，皂化值越大，脂肪酸相对分子质量越小，大花黄牡丹籽油皂化值在药典规定的注射用油皂化值185～200 mgKOH/g 范围内；大花黄牡丹籽油过氧化值小于1.56 mmol/kg，远低于国家标准限量值，说明本实验所提取的油中双键被氧化程度低。总体上，大花黄牡丹籽油理化指标均符合LS/T 3242—2014《牡丹籽油》。所用的 2 种溶剂中，正己烷提取出油率高，油脂色泽和透明度、碘价、酸价、皂化价等指标与石油醚提取差异小，操作安全性优于石油，为大花黄牡丹籽油的理想溶剂。

表5 正交实验方差分析

表6 大花黄牡丹籽与其他牡丹籽油脂理化性质比较

与相关文献相比较，发现大花黄牡丹籽油的碘价略低于各地各类牡丹籽油，与湖南湘西的野生牡丹籽油基本一致；酸价、过氧化值与滇牡丹籽油接近，除高于湖南湘西的野生牡丹籽油外，明显低于其他牡丹籽油；皂化价与各地各类牡丹籽油的差异小；折光指数略小于其他牡丹籽油[29-32]。总体上，西藏大花黄牡丹籽油的理化特性与滇牡丹籽油、湘西野生牡丹籽油较接近，均属于优质油脂。

2.5 大花黄牡丹籽油的部分功能成分

分别检测了大花黄牡丹籽油中角鲨烯和VE部分甾醇含量，结果见表7。

表7 大花黄牡丹籽油的部分微量活性物质含量

从表7可知，大花黄牡丹籽油中VE总含量达550.27 mg/kg，以γ-生育酚为主。经典理论认为α-生育酚是活性最高，营养效价最好的VE，而近年来一些研究表明,γ-生育酚可能是VE实际上的心血管保护成分,并有抗癌和防癌作用[33]，因此大花黄牡丹籽的保健作用值得深入研究；在大花黄牡丹籽油中检测到β-谷甾醇4.94 μg/mL，岩藻甾醇4.33 μg/mL，角鲨烯153.67 μg/mL，与内地牡丹籽油相比，甾醇含量偏低，而角鲨烯则高出2～4倍[34]。

2.6 大花黄牡丹籽油的脂肪酸分析

经过GC-MS检测分析得到脂肪酸甲酯标准品总离子流图和大花黄牡丹籽油样品离子流图，见图3。大花黄牡丹籽油样品检测出20种脂肪酸，见表8，其中饱和脂肪酸为14种，单不饱和脂肪酸3种，多不和脂肪酸为3种。依据峰面积归一化法计算，棕榈酸(9.31%)、油酸(41.03%)、亚油酸(16.02%)、α-亚麻酸(29.90%)是大花黄牡丹籽油的主要脂肪酸成分。油脂以不饱和脂肪酸为主，相对质量分数87.44%，其中多不饱和脂肪酸相对质量分数为46.04%。α-亚麻酸具有降低血脂及胆固醇，促进脂肪代谢及肝细胞再生等功效，被誉为“植物脑黄金”。普通的牡丹籽油中α-亚麻酸质量分数在32%以上[35]，西藏大花黄牡丹籽油α-亚麻酸含量比普通牡丹籽油低，而西藏大花黄牡丹籽含油量比普通牡丹籽高。

表8 大花黄牡丹籽油主要脂肪酸组成

本实验对大花黄牡丹籽油脂肪酸的分析结果与曾秀丽等[22]的分析结果相近，证明了西藏大花黄牡丹籽油与普通牡丹籽油的脂肪酸在组成与含量上均有较大的差别。西藏大花黄牡丹籽油主要脂肪酸中，油酸>α-亚麻酸>亚油酸>棕榈酸>硬脂酸，而多数普通牡丹籽油α-亚麻酸含量最高，通常是亚麻酸>亚油酸>油酸>棕榈酸>硬脂酸。大花黄牡丹籽油是优质的 ω-3保健食用油，在医药工业、高级化妆品、高级润滑油等领域有良好的应用前景。

3 结论

西藏大花黄牡丹籽去壳样品含油量为(39.51±1.04)%，带壳样品含油量为(28.26±1.22)%；通过L16(215)正交设计优化提取工艺，得到最佳提取工艺为处理温度60 ℃、超声提取时间50 min、超声功率160 W、样品粒度100目、液料比12 mL/g。在此工艺条件下大花黄牡丹籽的出油率为(38.24±0.63)%，占大花黄牡丹籽含油量的97%，说明正交设计优化结果适合于大花黄牡丹籽油提取工艺，为西藏大花黄牡丹籽油规模化提取工艺提供了参考。2种溶剂提取的大花黄黄牡丹籽油理化指标均符合LS/T 3242—2014要求并处于优质水平。正己烷提取的大花黄牡丹籽油中检测出以γ-生育酚为主的VE总含量550.27 mg/kg，β-谷甾醇4.94 μg/mL，岩藻甾醇4.33 μg/mL，角鲨烯153.67 μg/mL。牡丹籽油中含20种脂肪酸组分，主要由亚麻酸、亚油酸、油酸、棕榈酸组成，其中亚麻酸占总脂肪酸含量的29.90%。大花黄牡丹籽油中含不饱和脂肪酸6种，占其脂肪酸总量的87.44%，其中单不饱和脂肪酸3种，占41.40%，多不和脂肪酸为3 种，占46.04%，饱和脂肪酸占其总量的12.56%。