猪Delta冠状病毒病的诊断与防控研究进展

王先松，郭世洪，赵 瑶，张德志,2，李前勇,2

(1.西南大学动物科学学院，重庆 荣昌 402460 ; 2.重庆市兽医工程技术研究中心，重庆 荣昌 402460)

猪Delta冠状病毒病是由猪Delta冠状病毒(Porcine Deltacoronavirus，PDCoV)引起的猪的一种急性肠道传染病，各生长阶段猪均能感染，哺乳仔猪最易感。被感染猪主要表现为持续呕吐、水样腹泻和脱水等症状。该病病原最先于2012年在我国香港发现，随后在世界多个国家和地区被检测出。有资料指出，该病将会在我国及周边呈现大量发生，严重威胁着生猪健康及养猪业安全。

1 PDCoV的病原特征与流行病学

PDCoV是属于尼多病毒目(Nidovirales),冠状病毒科(Coronaviridae),冠状病毒属(Coronavirus)的单股正链RNA病毒，电镜下呈直径80～160 nm的球体，有典型的冠状颗粒。基因组大小为25.421～26.674 kb，是最小的冠状病毒，共编码4种结构蛋白和4种非结构蛋白，基因组排列顺序为5′非编码区(5′UTR)、开放阅读框(ORF1A/1B)、纤突蛋白(S)、包膜蛋白(E)、膜蛋白(M)、非结构蛋白NS6、核衣壳蛋白(N)、非结构蛋白NS7、3′非编码区(3′UTR)，与其他动物的Delta冠状病毒基因组特征和结构相似[1-2]。

自2012年PDCoV首次在香港被检出，随后在美国、加拿大、日本、韩国、老挝、越南和泰国等国家已发现了数十株PDCoV毒株[3-6]。同时PDCoV也在我国黑龙江、广东、广西、海南、四川、台湾、贵州、湖北等多个地区被检测到，表明PDCoV流行趋势越来越严重。由于冠状病毒独特的基因组复制方式，PDCoV的RNA极易发生突变和重组，使该病的预防和控制变得更加困难[7]。

2 PDCoV病的症状与致病机制

PDCoV能够感染各日龄猪群，以猪肠绒毛萎缩、呕吐、腹泻和脱水为特征，尤其对哺乳仔猪具有较强的致病性，病死率一般为30%～40%，有时可高达100%。剖检可见肠壁变薄、肠腔内充满黄色液体，胃和小肠内有未消化的凝乳块，有的小肠黏膜充血、出血，肠系膜呈索状充血等[8]。

病毒接种仔猪后4～7 d内观察到肠绒毛萎缩，隐窝深度增加。研究者用免疫组织荧光法只能在感染猪的十二指肠、空肠、回肠检测到荧光，而用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法在肠道、肠系膜淋巴结、胃、心、肝、脾、肺、肾、扁桃体、膈肌、肌肉、血液中均检测到该病毒，与猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)的结果不一致[9-10]。PDCoV的致病机制尚不完全清楚，最新研究表明，存在于细胞膜和病毒包膜中的胆固醇，通过作为病毒进入的关键成分而促进PDCoV复制[11]。Wang等发现PDCoV使用猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroonteritis virus, TGEV)功能受体-猪氨基肽酶N(pAPN)进入细胞，证明pAPN是跨属冠状病毒的功能受体，该受体的鉴定为进一步研究PDCoV与宿主的相互作用及发病机制提供了重要参考[12]。

3 PDCoV病的诊断

鉴于PDCoV病的临床症状和病理变化与猪流行性腹泻(Porcine epizootic diarrhea, PED)、猪传染性胃肠炎(Transmissible gastroonteritis,TGE)、仔猪黄痢等猪肠道疾病非常相似，且易发生混合感染，临床上难以鉴别诊断。目前，对PDCoV病的诊断主要有病原学诊断和免疫学诊断(表1)。

3.1 病原学诊断

表1 PDCoV检测

3.1.1 病毒分离培养鉴定 病毒的分离培养可为PDCoV感染提供最直接的病原学依据，也为进一步的病毒学研究提供材料。Jang等将PDCoV阳性样本接种到猪睾丸(ST)细胞进行病毒的分离传代,成功分离得到了PDCoV HB-BD株。通过对分离株的S、M和N基因进行测序鉴定及经序列同源性分析，发现HB-BD分离株S、M和N基因与近年来国内外的流行病毒核苷酸同源性分别为95.8%～99.1%、98.6%～99.4%和97.8%～99.4%，亲缘性分析表明，HB-BD与中国毒株处于同一分支[13]。

3.1.2 电子显微镜检查 电镜技术可以最直观地观察到PDCoV粒子的形态和大小。Xu等使用电子显微镜对纯化的PDCoV CHN-GD-2016进行检测，观察到PDCoV病毒粒子呈直径80～160 nm的球形，粒子外包裹着一层囊膜，囊膜外有密集的尖刺状纤突[2]。由于病毒粒子形态和其他冠状病毒差别不大，仅从形态学上很难确诊PDCoV，因此需要结合其他手段才能准确诊断。

3.1.3 反转录-聚合酶链反应(RT-PCR) RT-PCR技术广泛应用于RNA病毒检测，可实现微量的核酸大幅扩增，提高检测效率。韦学雷等根据PDCoVN基因、PEDVM基因和TGEVN基因设计合成了3对特异性引物,构建重组质粒,并对RT-PCR反应条件进行优化,建立了检测PDCoV, PEDV和TGEV的多重RT-PCR诊断方法，结果显示，与常规单一RT-PCR的结果完全符合，且能有效避免对猪博卡病毒(PboV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)和猪圆环病毒(PCV)等猪常见病毒的误诊[14]。Hu等根据编码Alpha、Beta、Gamma和Delta冠状病毒最保守的蛋白结构域设计了1套新的引物来扩增RNA依赖性RNA聚合酶(RdRP)基因中的668 bp区域，建立一步法RT-PCR测定标准，反转录和PCR顺次进行,其敏感性和特异性为100%，可鉴别诊断动物的4种冠状病毒，且检出率高于普通RT-PCR方法[15]。

3.1.4 实时荧光定量RT-PCR(RT-qPCR) 相比RT-PCR，RT-qPCR检测方法更快速、更灵敏，逐渐被广泛应用于PDCoV检测。Masuda等根据PEDV和TGEVN基因、PDCoVM基因和猪A型轮状病毒(PRVA)VP6基因开发了一种新的多重Real time RT-PCR方法，可以在75 min内同时检测4种猪腹泻病毒，大大缩短诊断时间，其敏感性最高可达普通RT-PCR的1 000倍，而且没有出现假阳性[5]。张立卫等根据PDCoV毒株HKU15-155M基因和PEDV毒株CHLY-09ORF3基因序列设计特异性引物,建立并完善了能同时准确检测PDCoV和PEDV的SYBR Green I双重荧光RT-PCR检测方法，具有良好的敏感性和特异性[16]。

3.1.5 恒温绝热式RT-PCR(RT-iiPCR) RT-iiPCR与传统的RT-PCR检测方法相比,具有操作简便、快速高效、特异性强、仪器成本低等优点，已开始运用于各种病原体的检测。Zhang等使用PDCoVM基因，建立了PDCoV RT-iiPCR检测方法并与基于M基因的PDCoV RT-qPCR检测方法进行了比较，结果显示，PDCoV RT-iiPCR的敏感性、特异性和准确性均为100%[17]，具有极好的敏感性、特异性和准确性。

3.1.6 逆转录环介导的等温扩增(RT-LAMP) RT-LAMP为快速准确地鉴定病毒病原体提供了有效手段，其在等温条件下扩增出具有高灵敏度和特异性的核酸，这种新型基因检测技术有效地节省了时间和成本。Zhang等使用PDCoVN基因的保守序列片段作为靶区域，开发了单管一步法RT-LAMP法用于PDCoV诊断和监测，其灵敏度比RT-PCR高约100倍，且与PEDV、TGEV等6种病毒无交叉扩增[17]，特异性良好，是一种具有研究价值的方法。

3.2 免疫学诊断

3.2.1 酶联免疫吸附试验(ELISA) ELISA是血清学检测的常用方法之一。与其他猪冠状病毒相比，用于PDCoV病的ELISA诊断方法仍处于研发阶段。2015年Thachil等基于PDCoV-IA2014-1株S蛋白的S1结构域开发了间接ELISA，用于测定美国51个农场的PDCoV流行情况,发现在25.5%的农场中存在抗PDCoV IgG抗体，诊断灵敏度为91%，特异性为95%[18]。SU等开发了一种间接ELISA，以组织标记的重组PDCoV N蛋白作为抗原检测PDCoV的抗体，均未与TGEV、PEDV、猪轮状病毒A型(Porcine group A rotavi ruses, GAR)、CSFV、PCV-2、PRV、PRRSV发生交叉反应,具有100%的敏感性和90.4%的特异性[19]。国内Luo等建立了以PDCoV M蛋白为基础的间接ELISA法，检测了河北省抗PDCoV IgG情况，与抗TGEV、PEDV、RV、PCV-2、CSFV和PRRSV的抗血清无交叉反应，诊断敏感性为90.6%，特异性为93.3%[20]。

3.2.2 荧光微球免疫检测(FMIA) FMIA方法又被称为液相芯片技术，是集流式细胞技术、激光技术、数字信号处理技术及传统化学技术为一体的生物分子检测技术。Okda等使用碳化二亚胺偶联反应将纯化的重组PDCoV N蛋白抗原与荧光微球偶联，优化条件后得到最佳信噪比，诊断特异性为95.8%，敏感性为98.1%[21]。该方法敏感性通常高于ELISA，且适用于单一复杂样品中不同分析物的高通量、多重和同时检测，是一种正在发展的新型检测技术。

3.2.3 免疫荧光试验(IFA) Zhang等通过扩增PDCoV的N基因，用抗PDCoV N蛋白的单抗IFA和Western Blot检测了纯化的PDCoV CHN-HG-2017株在LLC-PK1细胞中的传染性。在感染后24 h时，大多数细胞中检测到PDCoV特异性免疫荧光，N蛋白主要定位于细胞质中[22]。

3.2.4 病理切片和免疫组织化学染色(IHC) Zhang等将被感染猪十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠和直肠组织制作成H.E.染色石蜡切片，结果显示，PDCoV感染仔猪的空肠和回肠绒毛变钝、碎裂，出现萎缩和空泡，淋巴细胞聚集和肠固有层充血。用PDCoV N特异性单克隆抗体孵育，然后用HRP缀合的山羊抗小鼠IgG二抗孵育的IHC结果与病理切片结果一致，在感染绒毛肠细胞的胞浆中检测到PDCoV抗原[22]。IFA 及 IHC 等原位检测方法主要优势在于可以显示PDCoV抗原的组织分布，但由于该方法的分析灵敏度较低，不能成为检测PDCoV的首选方法，多用于检测感染期抗体状况。

4 PDCoV病的防控措施

由于目前关于PDCoV的感染和传播研究较少，而且没有针对PDCoV开发有效商业化疫苗或治疗药物，因此只能借鉴其他病毒性腹泻病PED、TGE采取的综合性防制措施，从养猪生产的各个环节入手，坚持“预防为主，防重于治”原则，以减少疾病发生。

4.1 合理选择场址，严格引种检疫 场址应选在地势较高，干燥，阳光充足，水源良好，排污方便，污染较少的地方。猪场应远离公路、城镇居民区。生活区与生产区、隔离区要严格分开。引种前要确定所引进的猪已经有可靠的免疫,种源猪场应出具检疫证明。引种后需隔离观察1-2个月，经检疫合格后方可与本场猪合群。

4.2 加强饲养管理，提升抵抗能力 养殖场要提高饲料营养水平，杜绝饲喂变质饲料，保持营养平衡，从而提高猪只健康水平及其抵抗力。做好场内的生物安全，坚持自繁自养、全进全出原则。保持圈舍干净，减少病毒通过粪-口传播，保证通风换气，做好母猪产前乳房清洁和消毒以及产房的保温工作，同时应降低湿度，给予充足而干净的饮水，不要频繁地更换饲料。

4.3 重视消毒工作，辅以适当给药 及时控制传染源，切断传播途径，隔离已感染猪群和保护易感猪只；做好消毒工作，对清洁后的猪场使用化学消毒液消毒，增加对疫区的消毒频次。对发病猪可使用抗生素、抗炎药、抗病毒药物和液体电解质等，减少脱水和体重减轻等症状，降低因细菌或病毒的继发感染而引起的死亡。KM等发现市售饲料酸化剂(UltraAcid P,Activate D A,KEMGEST,Acid Booster, Luprosil, Amasil)和盐可降低饲料中传播PDCoV的风险，特别是在推荐浓度的2倍下可降低饲料中PDCoV的含量，但不能使病毒完全灭活[23]。有报道称，多克隆免疫血清可用于控制已发病猪群的感染[24]。

4.4 做好预防接种，减少混合感染 结合当地的动物疫情以及养殖场的生产实际情况制定合理的免疫程序，避免PDCoV与PEDV、TGEV、GAR等腹泻疾病混合感染。提高母猪的基础免疫可使仔猪获得高浓度的母源抗体，增强初生仔猪的抵抗力。国内常见有哈尔滨兽医研究所研发的PEDV、TGEV、GAR三联弱毒苗以及多种PEDV、TGEV、GAR三联灭活疫苗和PEDV、TGEV二联灭活疫苗等，各猪场可根据实际情况进行预防接种，控制仔猪腹泻疾病，减少与PDCoV的混合感染。

5 展望

PDCoV作为一种新发现的致病性病毒，人们对其的分子病原学、流行病学、致病机制等了解尚不够全面和深入，对PDCoV的预防和治疗方法的研究也较少。加强对该病毒NS6和其他辅助蛋白的功能的研究，可能对寻找新的治疗靶点和开发有效疫苗提供依据。已建立的PDCoV反向遗传系统，对研究病毒基因的突变或缺失、探索NS6缺失对IFN-β产生、病毒复制和宿主谱的影响等有很积极的意义。从当前全球PDCoV流行状况来看，该病毒蔓延速度非常快，并可能会在我国全面流行，因此迫切需要研制出针对PDCoV的疫苗来控制本病的传播。