正交试验优化超声波提取尾巨桉DH32-39树叶抗菌成分的工艺研究

●吴霖锋 鲍明隆 邱春妙 廖华维 张继东 刘晓曦

（广东海洋大学滨海农业学院广东湛江524000）

桉树是一种优良的经济树种，具有生长速度快、经济价值高等特点[1]。桉叶含有多种化学成分，主要包括桉叶精油、黄酮、有机酸等物质[2]。其中桉叶有效成分精油具有抑菌、消炎、抗氧化等生理活性[3]。桉叶的提取方法主要有溶剂提取法、超声波提取法和微波提取法等，其中超声提取法具有快速高效、保留有效活性成分等优点[2]，值得深入研究。金黄色葡萄球菌是常见的食源性致病菌，常导致机体局部皮肤、组织、器官发生化脓性感染，甚至是中毒性休克[4]。抗生素是控制金黄色葡萄球菌感染的有效措施，但细菌耐药性现象日趋严重[5]。研究发现，桉叶提取物对金黄色葡萄球菌有抑菌作用[6]，可作为抗生素的替代品。本实验以桉叶为原料，以金黄色葡萄球菌为研究对象，通过正交试验优化超声波提取桉叶抗菌成分的方法，以最低抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）评价桉叶提取物的抑菌、杀菌效果，最终确定超声波提取桉叶抗菌成分的工艺。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究对象桉叶采摘于广东海洋大学教学动物医院种植的尾巨桉DH32-39。金黄色葡萄球菌（ATCC26112）由广东海洋大学滨海农业学院微生物实验室保存。

1.1.2 主要试剂琼脂培养基，由杭州滨和微生物试剂有限公司生产；营养肉汤培养基，由杭州滨和微生物试剂有限公司生产；无水乙醇，由上海珊亿化工科技有限公司生产。

1.1.3 主要仪器多用途恒温超声提取机，北京弘祥隆生物技术开发有限公司（DCTZ-1000)；生化培养箱，上海博迅实业有限公司医疗设备厂（SPX-250B-Z型)；流线型支架粉碎机，温岭市林大机械有限公司（DFY-1000C)；台式低速离心机，湖南赫西仪器装备有限公司（TDZ5台式低速离心机)。

1.2 方法

1.2.1 样品处理将尾巨桉DH32-39树叶置于通风处阴干获得饮片；用流线型支架粉碎机粉碎干燥的桉树叶15s，获得桉叶碎片；将粉碎的桉叶经20目检验筛均匀摇晃，获得20目粒度桉叶，备用。

1.2.2 正交试验称取10g桉叶（饮片、破碎、20目粒度）置于烧杯中，加入30mL的蒸馏水。正交试验选取提取时间、超声波功率及粒度3个因素，每个因素3个水平，进行L9(34)正交试验，优化超声提取桉叶。因素与水平设计，见表1。超声后获得的桉叶提取液，经4层纱布过滤取滤液，离心机4 000r/min离心8min，过滤，加热浓缩至10mL（药液最终浓度为1g/mL)。121℃高压蒸汽灭菌，4℃温度条件下保存。

1.2.3 不同浓度乙醇作为提取溶剂的对比试验以

1.2.2 正交试验优化后的超声波提取工艺获得桉叶提取物。在此工艺条件基础上，探讨不同浓度（50%~100%）的乙醇对桉叶提取液抑菌、杀菌效果的作用。桉叶的处理：取10g桉叶置于烧杯中，分别加入30mL 50%~100%乙醇，以1.2.2正交试验优化工艺煎煮，离心，过滤，加热浓缩至10mL。

1.2.4 菌液制备将金黄色葡萄球菌菌种和海豚链球菌菌种分别接种于营养肉汤中，置于37℃恒温箱中培养18h。用接种环蘸取适量菌液，在营养琼脂平板中划线培养24h，挑取单个菌落置于10mL无菌营养肉汤中，制成菌液。

1.2.5 桉叶提取液对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度(MIC)在无菌条件下，取无菌试管10支，第1管加1.6mL营养肉汤，第2~10管各加1mL营养肉汤。吸取桉叶提取液0.4mL（浓度为1g/mL）加入第1管中，混匀。在第1管中吸取1mL混合液加入第2管中，混匀。按此方式依次倍比稀释至第10管。此时，1~10号管中桉叶提取液的浓度分别为200mg/mL、100 mg/mL、50mg/mL、25mg/mL、12.5mg/mL、6.25mg/mL、3.125mg/mL、1.563mg/mL、0.781mg/mL和0.391mg/mL。在试管中加入10L菌液，在37℃恒温箱中培养24h。肉眼观察试管内液体情况，如液体澄清，说明试管内无细菌生长，液体浑浊则说明试管内有细菌生长。以无细菌生长的液体浓度记为桉叶提取液对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度（MIC）。

1.2.6 桉叶提取液对金黄色葡萄球菌的最小杀菌浓度(MBC)在无菌条件下，用接种环蘸取1.2.5中1~10号管37℃培养24h后的菌液，接种于营养琼脂平板上，在37℃恒温箱中培养18h。观察结果，以营养琼脂平板上无细菌生长的最低菌液浓度记为桉叶提取液对金黄色葡萄球菌的最小杀菌浓度(MBC)。

2 结果

2.1 不同超声提取工艺对于金黄色葡萄球菌的MIC影响的试验结果

通过正交试验超声提取的桉叶提取液对金黄色葡萄球菌的抑制效果，见表2。以水平组合A2B1C2超声提取的桉叶提取液对金黄色葡萄球菌的MIC为0.781mg/mL，是9种水平组合中的最低值，说明该条件下获得桉叶提取液对金黄色葡萄球菌的抑菌效果最好。其他条件下超声提取的桉叶提取液对金黄色葡萄球菌的MIC在3.13~100mg/mL之间。

表2桉叶提取液对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度

续表2

2.2 不同超声提取工艺对于金黄色葡萄球菌的MBC影响的试验结果

通过正交试验超声提取的桉叶提取液对金黄色葡萄球菌的杀灭效果，见表3。在水平组合A2B2C3条件下，超声获得的桉叶提取液对金黄色葡萄球菌的MBC为12.25mg/mL，为9种水平组合中的最低值，此时桉叶提取液对金黄色葡萄球菌的杀菌效果最好。其他水平组合条件下超声获得的桉叶提取液对金黄色葡萄球菌的MBC在25~50mg/mL之间。

表3桉叶提取液对金黄色葡萄球菌的最小杀菌浓度

2.3 不同提取溶剂对于提取液抗菌、杀菌效果影响的试验结果

以蒸馏水对照，使用不同浓度的乙醇（50%~100%）作为提取溶剂，测定其提取液的MIC和MBC，结果见表4。蒸馏水、50%乙醇、60%乙醇、70%乙醇、80%乙醇以及90%乙醇的桉叶提取液的MIC均为1.6mg/mL，而100%乙醇的桉叶提取液的MIC为8mg/mL，蒸馏水、50%乙醇、60%乙醇、70%乙醇、80%乙醇的桉叶提取液的MBC均为40mg/mL，而90%和100%乙醇的桉叶提取液的MBC为8mg/mL，因此90%乙醇作为桉叶提取液的提取剂的效果最好，在选择提取溶剂时应使用90%乙醇。

表4桉叶乙醇超声提取液对金黄色葡萄球菌的MIC和MBC

3 讨论与结论

桉树作为一种我国南方重要的速生高产人工林树品种[7]，其树叶中含有大量的活性成分，包括桉叶精油、黄酮类、鞣质、多酚等[8]。桉叶精油对于金黄色葡萄球菌有较好的灭杀效果[6]。桉叶活性成分的提取方式有很多，常见的包括溶剂提取法和超声提取法，目前国内应用较多的为溶剂提取法，但超声提取法相对于溶液提取法具有快速高效、可保留热敏物质和易氧化物质的特点[2]，本试验选择以超声提取法中不同提取时间、超声功率、原料粒度以及不同溶剂为变量，以桉叶提取液对于金黄色葡萄球菌的MIC、MBC为衡量标准，尝试优化桉叶的超声提取工艺。

正交试验中不同的提取时间、超声功率、原料粒度的组合，会使桉叶提取液对于金黄色葡萄球菌的MIC产生明显差异，MIC处于0.781~100mg/mL之间。其中A2B1C2超声工艺提取的桉叶提取液对金黄色葡萄球菌的MIC为0.781mg/mL，为所有数值中的最低值。同时通过极差分析可知，各因素影响金黄色葡萄球菌最小抑菌浓度的顺序为：中药粒度（C）>超声功率（B）>时间（A），见表2。在正交试验中不同的提取时间、超声功率、原料粒度的组合会造成桉叶提取液对于金黄色葡萄球菌的MBC存在明显差异，MBC处于12.25~50mg/mL之间。其中A2B2C3超声工艺提取的桉叶提取液对金黄色葡萄球菌的MBC为12.25mg/mL，为所有数值中的最低值。通过极差分析可知，各因素影响金黄色葡萄球菌最小杀菌浓度的顺序为：中药粒度（C）>时间（A）>超声功率（B），见表3。

综合分析正交试验的试验结果，中药粒度是最大的影响因素，颗粒细化程度最高的是20目粒度，故将粒度确定为20目。正交试验结果显示提取时间在2水平为最佳，时间确定为10min。在超声功率的3个水平中，正交试验MIC结果显示，在B因素中1水平结果最差；正交试验MBC的结果显示，在B因素中3水平的结果最差，所以B因素中的1水平和3水平都不是最优的选项，故选取2水平的超声功率480W。所以桉树叶的最佳提取工艺可以确定为：桉叶粒度20目、超声波功率480W条件下超声10min。考虑到提取溶剂会对桉叶提取物的抗菌杀菌能力产生影响，本试验以蒸馏水为参照，探讨不同浓度的乙醇（50%~100%）桉叶提取物抑制、杀灭金黄色葡萄球菌的能力变化。结果发现，较高浓度的乙醇（90%~100%）桉叶提取物对金黄色葡萄球菌的MBC由40mg/mL降至8mg/mL，表明较高浓度的乙醇（90%~100%）增强了尾巨桉DH32-29桉叶杀灭金黄色葡萄球菌的能力，而以90%乙醇为溶剂的桉叶提取液的MIC和MBC数值最小，说明此时桉叶提取液抑制、杀灭金黄色葡萄球菌的能力最强，效果最好。

最终结论，尾巨桉DH32-39桉叶最佳超声提取工艺为：90%乙醇作为提取溶剂，桉叶粒度20目，超声波功率480W条件下超声10min。