金诃含片促进巨噬细胞吞噬功能作用研究

张义智，邵成雷，单玉刚，王海苹，侯晓群通讯作者）

（1.金诃藏药（山东）健康产业有限公司，山东 济南 250101；2.青岛市市立医院，山东 青岛 266011）

1 实验目的

观察评价金诃含片对活性炭处理的斑马鱼模型巨噬细胞免疫功能的促进作用，为金诃含片在抗PM2.5领域开发提供参考。

2 实验动物

黑色素等位基因突变型Albino品系斑马鱼240尾，自然成对交配繁殖方式进行，受精后2天，用于金诃含片对巨噬细胞吞噬功能的促进作用实验。

上述Albino品系斑马鱼均饲养于28℃的斑马鱼专用养殖水中（pH为6.9-7.2；速溶海盐含量200 mg/L；电导率为485-505μS/cm的反渗透水；硬度为53.5-71.5 mg/LCaCO3），实验动物试验使用许可证号为：SYXK（浙）2012-0171。斑马鱼饲养管理完全符合国际AAALAC认证相关要求[1-5]。

3 实验药物

金诃含片，棕色粉末，于2017年09月11日收样，由金诃藏药（山东）健康产业有限公司提供，常温阴凉避光保存。使用前用超纯水配制成浓度为50mg/ mL的溶液，-20℃保存。临用时用养鱼水按需稀释。

金嗓子喉片，市售成品，棕褐色片剂，批号17031301，于2017年09月11日收样，由金诃藏药（山东）健康产业有限公司提供，常温阴凉避光保存。临用前用超纯水配制成浓度为200 mg/ mL的母液，-20℃保存。临用时用养鱼水按需稀释。

4 仪器与试剂

解剖显微镜（SZX7，OLYMPUS，Japan）；6孔板（Fisher Scientific，China）；精密电子天平（CP214，奥豪斯）；显微注射仪（IM-300，Narishige）；拉针仪（PC-10，Narishige，Japan）；中性红（Sigma，China）；甲基纤维素（Sigma，China）。

5 浓度组别

实验1组 正常对照组；实验2组 模型对照组；实验3组 金诃含片56 µg/ mL；实验4组 金诃含片167 µg/mL；实验5组 金诃含片500 µg/ mL；实验6组 金嗓子喉片 222 µg/ mL；实验7组 金嗓子喉片 667 µg/ mL；实验8组 金嗓子喉片 2000 µg/ mL。

6 浓度确定依据

根据金诃含片（对斑马鱼的最大耐受浓度（MTC）为500 µg/ mL）和金嗓子喉片（对斑马鱼的最大耐受浓度（MTC）大于2000 µg/ mL）对斑马鱼的最大耐受浓度（MTC），确定对巨噬细胞吞噬功能的促进作用评价浓度为：金诃含片分别为56 µg/ mL（1/9 MTC）、167µg/ mL（1/3 MTC）和500 µg/ mL（MTC）浓度；金嗓子喉片分别为222 µg/ mL（1/9 MTC）、667 µg/ mL（1/3 MTC）和2000 µg/ mL（MTC）浓度。

7 模型制作

将2.3 mg/ mL纳米活性炭作为PM2.5纳米颗粒，注射到2 dpf斑马鱼的静脉中（相当于人静脉注射），每尾斑马鱼注射10 nL，即以23 ng/尾的剂量建立斑马鱼PM2.5吞噬模型。

8 实验方法

随机选取240尾受精后2天（2 dpf）黑色素等位基因突变型Albino品系斑马鱼，静脉注射给予纳米活性炭（PM2.5）建立斑马鱼巨噬细胞吞噬功能评价模型。模型斑马鱼分别水溶给予金诃含片56、167、500 μg/ mL浓度和金嗓子喉片222、667、2000 μg/ mL浓度，同时设置正常对照组和模型对照组，每孔（实验组）均处理30尾斑马鱼，每孔容量为3 mL，并且每天更换药液。金诃含片和金嗓子喉片处理2天后，加入中性红溶液对斑马鱼进行活体染色，染色结束后统计吞噬了纳米活性炭的巨噬细胞数量（N），以巨噬细胞吞噬促进率评价金诃含片对斑马鱼体内巨噬细胞吞噬功能的影响。金诃含片对斑马鱼巨噬细胞吞噬功能的促进作用计算公式如下：

用方差分析和Dunnett’s T-检验进行统计学分析，P＜0.05表明具有显著性差异，提供具有代表性的实验图谱。

9 实验结果

金诃含片浓度为56和167 μg/ mL时，斑马鱼吞噬的纳米活性炭的巨噬细胞数量分别为44和38个，与模型对照组（28个）比较P＜0.001，其对斑马鱼巨噬细胞吞噬促进率分别为53.5%和32.7%；在500 μg/mL浓度时，斑马鱼吞噬的纳米活性炭的巨噬细胞数量为34个，与模型对照组比较P＜0.01，其对斑马鱼巨噬细胞吞噬促进率为19.0%。提示金诃含片在56、167和500 μg/mL浓度时对斑马鱼巨噬细胞吞噬功能都有明显的促进作用[6-9]。金嗓子喉片浓度为222、667和2000 μg/ mL时，斑马鱼吞噬的纳米活性炭的巨噬细胞数量分别为41、45和40个，与模型对照组（28个）比较P＜0.001，其对斑马鱼巨噬细胞吞噬促进率为44.7%、56.7%和41.9%，提示金嗓子喉片在222、667和2000 μg/mL浓度时对斑马鱼巨噬细胞吞噬功能有明显的促进作用，见表1-2。

表1 金诃含片对斑马鱼巨噬细胞吞噬功能促进作用实验结果

10 实验结论

本实验结果表明，金诃含片对斑马鱼巨噬细胞吞噬功能有明显的促进作用。国内外文献报道，斑马鱼模型在现代药学研究中关于疾病动物模型、药物活性筛选及代谢研究方向的研究取得了很大进展[10-11]。本实验首次将斑马鱼模型用于评价抗雾霾作用，为其拓展应用提供了参考。