棉酚致蛋鸡肝脏脂沉积机制研究

王倩倩 秦卫红 陈大伟

摘要：旨在探討游离棉酚引起的蛋鸡肝脏脂质过氧化与脂肪沉积的关系，试验将360只42周龄京粉2号商品代蛋鸡随机分为4组，对照组（C组）饲喂基础饲粮，3个试验组分别在基础日粮中添加醋酸棉酚100 mg/kg（L组）、200 mg/kg（M组）、400 mg/kg（H组），喂饲42 d后，测定血清中甘油三酯（TG）、总胆固醇（CHOL）、谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）和高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）含量，屠宰后测定肝脏脂肪酸含量和脂质过氧化指标，制备病理切片和超薄切片。结果表明，醋酸棉酚导致血清中AST、ALT升高，呈现时间与剂量效应。试验第4周、第6周时，M、H组血清中TG和LDL-C极显著升高（P<0.01），H组血清中CHOL和HDL-C显著升高（P<0.05）;病理切片观察发现棉酚导致蛋鸡肝脏脂肪变性，并且呈一定的剂量效应。在肝脏脂肪酸中，醋酸棉酚使不饱和脂肪酸组成降低，饱和脂肪酸比例升高。试验组肝脏SOD、GSH-Px活性、GSH含量显著降低（P<0.05），MDA显著升高（P<0.05）。超微结构观察发现棉酚对蛋鸡肝脏细胞线粒体结构造成损伤。

关键词：醋酸棉酚;蛋鸡;肝脏;脂肪酸

中图分类号：F592.99         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2020）10-0116-004

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.10.027            开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Abstract： This research was conducted to investigate the effects of free gossypol on fatty acid in liver， lipid peroxidation index and serum index of laying hens. A total of 360 healthy 42-week-old Beijing pink 2 laying hens were randomly divided into 4 groups with 3 replicates per group and 30 hens per replicates. Laying hens in 4 groups fed the basal diet supplemented with gossypol acetate 100 mg/kg （group L）， 200 mg/kg （group M）， 400 mg/kg （group H） and 0 mg/kg （group C）. The experiment lasted for 42 days. TG， CHOL， AST， ALT， LDL-C and HDL-C were determined with biochemical analyzer. At the end of the test， laying hens were executed with bleeding， the livers were collected to determine the fatty acids and lipid peroxidation， also pathological and ultrastructure observation. The results showed that the activity of AST， ALT increased with exposed to Gossypol acetate， showing the time and dose effect. At the 4th and 6th week， TG and LDL-C have increased very significantly （P<0.01）， TC and HDL-C also increased significantly（P<0.05）. Gossypol acetate decreased the unsaturated fatty acid composition and increased the saturated fatty acid proportion in liver. Liver lipid peroxidation index SOD， GSH-Px and GSH decreased significantly（P<0.05） and MDA increased significantly（P<0.05）. Gossypol acetate caused laying hens hepatic steatosis， and showed a dose effect. Gossypol acetate caused structural damage of mitochondria in liver of laying hens. In conclusion， gossypol acetate caused the oxidative stress damage in hepatocyte， further caused the structure and function damage of mitochondrial which played an important role in fat depositing in liver of laying hens.

Key words： gossypol acetate;laying hens;liver;fatty acid

棉酚又称棉子醇、棉毒素，是一种黄色多酚类物质，多以双醛式存在于锦葵科植物的器官中[1]。中国棉子粕资源丰富，2014年棉花产量为618万t[2]， 棉子粕产量可达500万t。但由于游离棉酚、环丙烯脂肪等抗营养因子的存在大大限制了棉子粕的使用。艾晓杰[3]研究发现， 日粮中游离棉酚含量高于100 mg/kg时，可抑制成熟的卵泡分泌雌二醇和孕酮，造成卵巢萎缩，严重者丧失繁殖能力。蛋鸡棉酚中毒时，会出现食欲减退，日渐消瘦四肢无力，严重者会抽搐，腹泻，呼吸困難，冠髯发绀甚至死亡[4]。

游离棉酚在动物体内排泄缓慢，在体内组织器官中具有蓄积效应，且最主要的蓄积器官是肝脏[5]。脂肪酸的β-氧化是体内脂肪酸分解的主要途径，供应体内所需的大量能量[6]。任何因素引起的细胞线粒体功能损伤都会造成其氧化功能下降，致使甘油三酯增多，导致肝脏脂肪变性[7]。焦洪超等[8]研究发现棉酚急性毒性中毒会引起血浆中ALT、AST水平显著升高，血液中TG显著降低。研究发现，140 mg/kg游离棉酚会引起海赛克斯蛋雏鸡贫血，并对维持肝脏正常的生理功能有不利影响[9]。游离棉酚引起的肝脏功能紊乱与氧化应激和脂肪沉积的关系尚不明确。

本研究以京粉2号商品代蛋鸡作为试验对象，在基础饲料中添加醋酸棉酚，研究其对蛋鸡肝脏脂质过氧化、脂肪酸组成和血清生化指标的影响，观察肝细胞的病理及超微结构的变化，探讨游离棉酚对蛋鸡肝脏脂肪代谢的影响及原因，为棉子粕在蛋鸡饲料中的合理应用提供理论依据。

1  材料与方法

1.1  试验动物

42周龄京粉2号商品代蛋鸡，由农业农村部家禽品质监督检验测试中心（扬州）家禽生产性能测定站提供。

1.2  试验设计及基础日粮

将360只42周龄京粉2号商品代蛋鸡随机分为4组，每组设3个重复，每个重复30羽。对照组、低剂量组（L组）在基础日粮中添加醋酸棉酚100 mg/kg，中剂量组（M组）添加醋酸棉酚200 mg/kg，高剂量组（H组）添加醋酸棉酚400 mg/kg。试验基础日粮组成及营养水平见表1。采用3层全阶梯笼养，每个重复单独给料，自由采食饮水，日常管理与免疫程序按常规进行，试验周期为6周。分别于试验第2周、第4周、第6周时，每个重复随机抽取10只鸡翅静脉采血5 mL，分离血清备测。试验周期结束时，每组随机抽取10只鸡屠宰，采集肝脏，部分制作切片，剩余制备成匀浆后-80 ℃保存待测。

1.3  测定指标及方法

1.3.1  血清指标的测定  使用全自动血清生化测定仪，测定血清中甘油三酯（TG）、总胆固醇（CHOL）、谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）的含量。

1.3.2  肝脏脂质过氧化指标的测定   按照南京建成生物工程研究所提供的方法，将肝脏组织制作成10%的匀浆液，检测相关酶的活性。

1.3.3  病理组织切片观察   取新鲜肝脏组织，固定于4%甲醛溶液中，每隔24 h更换1次甲醛溶液，更换2次，样本可长期保存。常规制作肝脏组织切片，HE染色观察并拍照。

1.3.4  肝脏超微结构观察   迅速采集刚处死蛋鸡的肝脏组织（切成约1 mm3小块）， 用新鲜配制的25 g/L戊二醛溶液固定后，常规制备超薄切片，在JEM-100CXⅡ型透射电镜（Philips公司）下观察并拍照记录。

1.4  数据统计

试验数据均以“平均值±标准误”表示，采用SPSS 17.0单因子方差分析数据，各处理间的平均值比较采用LSD及Duncans多重比较进行差异显著性检验。

2  结果与分析

2.1  醋酸棉酚对蛋鸡血清生化指标的影响

由表2可知，醋酸棉酚对血清中AST、ALT的影响呈现时间和剂量效应。与对照组比较，试验第2周时，H组血清中LDL-C显著升高（P<0.05）。第4周、第6周时，M、H组血清中TG和LDL-C有所升高，且差异极显著（P<0.01）。第4周、第6周时，H组血清中CHOL显著升高（P<0.05）， HDL-C显著升高（P<0.05）。

2.2  醋酸棉酚对蛋鸡肝脏中脂肪酸组成的影响

肝脏中脂肪酸组成测定结果见表3。由表3可以看出，试验组和对照组均未能检测出肉豆蔻酸和亚麻酸;与对照组比较，3个试验组棕榈酸和硬脂酸含量随着醋酸棉酚添加量的增加有升高的趋势，但差异不显著;棕榈油酸、亚油酸含量随着棉酚添加量的升高逐渐降低，H组中未检测出油酸，M组油酸显著降低（P<0.05）。棉酚使蛋鸡肝脏饱和脂肪酸升高，不饱和脂肪酸降低。

2.3  醋酸棉酚对蛋鸡肝脏脂质过氧化指标的影响

肝脏氧化应激指标测定结果见表4。由表4可以看出，与对照组比较，L组各项脂质过氧化指标与对照组不存在显著差异（P>0.05）;M组GSH-Px活性显著降低（P<0.05），SOD活性、GSH含量极显著降低（P<0.01）;H组SOD、GSH-Px、GSH均极显著降低（P<0.01）; M组和H组MDA含量均极显著升高（P<0.01）。

2.4  醋酸棉酚导致蛋鸡肝脏组织的病理变化及其对肝脏超微结构的影响

肝脏病理切片观察结果见图1。结果表明，对照组肝脏部分肝细胞胞浆内有少量小脂肪滴;低剂量组肝脏中局部肝细胞胞浆内有大量大脂肪滴;中剂量组肝脏中局部肝细胞胞浆内有大量较大脂肪滴;高剂量组肝脏中局部肝细胞胞浆内有大量大脂肪滴。相比于饲喂含醋酸棉酚日粮的蛋鸡，尤其是高剂量组的蛋鸡，对照组肝脏组织中发生明显的脂肪变性，肝脏结构紊乱，炎性细胞浸润，基本轮廓消失。

肝脏组织超微结构观察结果见图2。由图2可知，对照组线粒体内外膜结构完整，嵴完整，清晰，表明其功能正常;低剂量组线粒体结构基本完整，个别内部结构模糊;中剂量组线粒体外膜结构完整，部分嵴断裂，有空泡化的趋势;高剂量组线粒体大部分嵴断裂，内膜溶解，呈空泡化（图中箭头所示）。与对照组相比，试验组存在不同程度的脂滴增加的情况，且细胞中空泡数量增多。

3  讨论

游离棉酚的毒性主要是其结构中含有醛基和羟基，其在動物体内肝脏中会发生明显的蓄积作用[10]。日粮中添加棉粕会导致肝脏组织脂肪变性，肝小叶变性坏死。病禽剖检后发现为肝充血，胆囊肿大。已有的研究认为，棉酚与金属离子结合，破坏了离子原有的功能。棉酚与铁离子结合，干扰血红蛋白的合成，引起机体缺铁性贫血;与氨基酸残基结合，可使一些蛋白质及蛋白酶类失去活性。1976年，Abou-Donia[11]通过同位素标记技术研究了棉酚在肝脏亚细胞结构中的分布，发现棉酚主要聚集在微粒体和线粒体膜上，在胞核内的含量则很少。

AST和ALT是肝功能检查中的一项重要指标，其偏高提示肝脏可能出现不同程度的损伤，如急性肝炎、酒精肝和脂肪肝等。丁耿芝等[12]研究表明，随着游离棉酚含量的增加，ALT和AST呈上升趋势，表明肝脏受到一定程度的损害。Braham等[13]和Abou-donia等[14]研究显示，棉酚可引起肝脏损伤，导致AST活性升高。杨茹洁[15]也发现高棉酚饲粮对蛋鸡AST的活性影响极显著，并且有时间效应。本试验中也发现此变化，呈现时间与剂量效应。血清中LDL-C、TG、CHOL、HDL-C等指标的变化，提示蛋鸡摄入游离棉酚后出现肝脏损伤和脂肪沉积。这与焦洪超等[16]的研究结果较为相似，蛋鸡饲料中添加棉酚后造成蛋鸡肝脏脂肪代谢异常。通过对脂肪酸组成的研究发现，游离棉酚影响了肝脏的脂肪酸组成，导致饱和脂肪酸升高、不饱和脂肪酸下降。

动物机体在正常情况下，处于动态的氧化平衡中，当机体受到不良应激时，该平衡就会被打破，表现为抗氧化能力降低或机体产生过多的氧自由基[17]。SOD在细胞浆中和线粒体基质中起重要的防御作用[18]， SOD是机体抗脂过氧化酶促防御系统中的一个重要酶，能有效清除氧自由基。GSH-Px可清除线粒体及胞浆中所产生的H2O2和脂类中的H2O2。MDA为脂质过氧化产物，当机体氧自由基升高时，MDA也会显著升高。当自由基在高浓度时，会引起机体氧化损伤。同时会造成DNA、蛋白质及脂肪损伤。其中脂肪损伤主要攻击的对象是不饱和脂肪酸。在细胞内，棉酚可以结合在内质网和线粒体膜，同时棉酚与氨基酸非特异性共价结合使棉酚成为普遍的酶抑制剂[19]。本研究表明，随着棉酚剂量的增加，蛋鸡肝脏中SOD、GSH-Px活性逐渐降低，MDA含量逐渐升高，且呈一定的剂量效应关系，表明棉酚引起蛋鸡肝脏的氧化损伤，这也是造成肝细胞脂肪沉积的原因之一。

张志峰等[20]研究报道， 饲粮游离棉酚含量为162.5 mg/kg时，导致育肥猪中毒死亡，剖检发现其肝脏体积增大，质地变硬，呈现暗红色，腹腔中有大量炎性渗出物，切片观察发现部分肝细胞萎缩坏死，结构模糊，小叶间纤维结缔组织增生，间隔增宽。刘锡民[21]报道，棉酚中毒患者临床上均有不同程度的肝细胞萎缩和轻度脂肪变性。焦洪超[7]研究发现饲喂40、200 mg/kg棉酚及腹腔注射棉酚导致蛋鸡肝脏组织结构紊乱，肝细胞轮廓消失，肿胀、炎性浸润，并且有明显的脂肪变性。本研究发现游离棉酚导致肝脏最主要的病理变化就是肝细胞脂肪变性，进一步对肝细胞超微结构观察发现，游离棉酚对线粒体产生损伤，并且呈一定的剂量效应。因此，肝细胞中脂肪的堆积可能与线粒体受损导致的氧化功能下降有关，而线粒体的受损又进一步加剧了肝细胞的氧化应激。

综上所述，醋酸棉酚引起蛋鸡肝脏细胞氧化应激损伤，导致线粒体等细胞器功能受损氧化功能下降在蛋鸡肝脏的脂肪沉积过程中发挥了重要作用。

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