斑点酶联免疫分析仪校准用模拟斑点标准物质*

/ .上海市计量测试技术研究院；.中国计量科学研究院；.艾迪创格（北京）科技有限公司；.德国艾迪（AID)公司

0 引言

斑点酶联免疫技术（Enzyme-linkedimmunospot,ELISPOT）在单细胞水平检测分泌抗体的细胞或分泌细胞因子的细胞情况下，统计斑点形成细胞的数目（即斑点计数）。斑点计数是ELISPOT数据处理最重要的一步，斑点酶联免疫分析仪可以对ELISPOT板上各孔斑点图像进行全自动采集、计数及分析，从而评价机体的细胞免疫或体液免疫功能，广泛应用于疫苗研究、药物筛选、感染性疾病诊断与研究及肿瘤免疫研究等免疫学相关领域[1-4]。值得一提的是，在疫苗的临床评价中，斑点酶联免疫分析仪已经被强制性用于ELISPOT中[5]，能够有效避免偏差，增加客观性、重复性及计数速度。但是，目前国内外尚无通行的斑点酶联免疫分析仪校准方法。

由于细胞保存条件苛刻，稳定性差，不便携带，不适合做斑点酶联免疫分析仪校准用标准物质。本文根据斑点酶联免疫分析仪的技术参数，结合酶联斑点的培养生长特性，研制了模拟斑点标准物质，量值准确可靠，便于存放和携带，均匀性和稳定性良好，为斑点酶联免疫分析仪的校准工作提供实验基础。

1 实验部分

1.1 主要仪器

晶元光罩影像式坐标测量仪[七海测量技术（深圳）有限公司]，通过计量机构的校准保证仪器测量的溯源性，每次使用前，用校准过的标准板进行确认，确保仪器处在正常工作状态。

1.2 模拟斑点标准物质的制备

1.2.1 图案设计

根据斑点酶联免疫分析仪的技术参数，采用AutoCAD设计模拟斑点标准物质图形，将模拟斑点最终成像在塑料膜片上，见图1：（1）膜片尺寸及孔位与标准96孔板一致；（2）A1、A12、H1、H12孔为定位孔：设计为“SIMT”字样；（3）模拟斑点孔均匀分布在标准96孔板上：E3、B6、G6、E9孔分别设计50、100、200、500个直径为50μm的模拟斑点。

1.2.2 外形设计

外形参照标准96孔板，长为12.7cm，宽为8.5cm，高为1.3cm，外部包括上、下金属框架，内部包括白色背景纸、高透光塑料膜片和玻璃片，上、下金属框架依靠螺钉连接紧固，具体构造如图2所示。

图1 模拟斑点标准物质图案

图2 模拟斑点标准物质外形

1.3 检测方法

利用光罩影像式坐标测量仪分别拍摄模拟斑点标准物质的E3、B6、G6、E9孔，并打印在纸上，采用人工识别计数的方法，适用于均匀性检验、稳定性考察以及定值实验。

1.4 均匀性检验

由于本批模拟斑点标准物质候选物制备了200块，根据JJF1343-2012《标准物质定值的通用原则及统计学原理》规定[6]，随机抽取模拟斑点标准物质候选物15块，按照1.3中的方法进行检测，每块计数三次。

1.5 稳定性考察

分别对本批模拟斑点标准物质候选物进行短期和长期稳定性考察。

1.5.1 短期稳定性考察

短期稳定性考察采用同步稳定性研究进行考察，即所有稳定性研究的测量均能在重复性条件下进行。实验模拟样品运输可能遇到的条件，将制备的模拟斑点标准物质候选物放置在-80℃冰箱、23℃实验室、70℃烘箱中，分别放置 1d、3d、6d、9d、14d，设置每个温度点和时间点各取3块，按照1.3中的方法进行检测。每个样品重复测定三次，进行短期稳定性考察。

1.5.2 长期稳定性考察

长期稳定性考察采用经典稳定性研究，即同时制备的样品在相同条件下随着时间的推移进行测量。采用先密后疏的原则安排在样品制备完成后当天、1个月、2个月、3个月、6个月、12个月，对制备的模拟斑点标准物质候选物随机抽取3块，按照1.3中的方法进行检测，每个样品重复测定三次，进行长期稳定性考察。

1.6 定值

本批模拟斑点标准物质采用多家实验室合作定值的方法，邀请了晶瑞测量技术（深圳）有限公司、七海测量技术（深圳）有限公司和上海讯量测控设备有限公司等八家单位进行联合定值，每个单位分别随机抽取3块模拟斑点标准物质候选物。为避免设计值的主导，应使实验人员保持对设计值的未知状态，按照1.3中的方法进行检测，每个样品重复测定三次，进行定值分析。

2 结果与讨论

2.1 检测方法

利用光罩影像式坐标测量仪拍摄模拟斑点标准物质的E3、B6、G6、E9孔内画面如图3所示，孔内的斑点清晰可见，均匀排布，适合用人工识别计数的方法。随机抽取一块模拟斑点标准物质候选物，按照1.3中的方法进行检测，重复七次，考察方法的重复性，精密度均为0%；随机抽取10块模拟斑点标准物质候选物，按照1.3中的方法进行检测，考察方法的再现性，精密度为0%，说明该方法重复性和再现性的精密度均较高，完全可以满足模拟斑点标准物质研制的需求。

图3 模拟斑点标准物质孔内画面

2.2 均匀性检验

采用人工识别计数法对本批模拟斑点标准物质候选物随机抽取的15个单元进行均匀性检验，数据如表1所示，可以看出模拟斑点标准物质的E3、B6、G6、E9孔内斑点个数均为设计值，证明该批标准物质都是均匀的。

2.3 稳定性考察

稳定性是标准物质的基本属性[6,7]，保持候选物稳定性的措施必须贯穿标准物质研制的全过程。由于标准物质在使用过程中不可避免要涉及运输等因素，因此，对本批模拟斑点标准物质候选物分别进行了短期和长期稳定性考察。

表1 模拟斑点标准物质均匀性检验结果

2.3.1 短期稳定性考察

实验模拟了标准物质运输过程中可能遇到的极端条件，按照1.5.1中的方法进行短期稳定性考察，实验数据如表2所示，可以看出模拟斑点标准物质的E3、B6、G6、E9孔内斑点个数均为设计值，证明模拟斑点标准物质在运输条件下是稳定的，满足实际运输要求。

2.3.2 长期稳定性考察

采用先密后疏的原则，按照1.5.2中的方法进行长期稳定性考察。实验数据见表3，可以看出在长达12个月的观察时间内，模拟斑点标准物质的E3、B6、G6、E9孔内斑点个数是不变的，均为设计值。因此，模拟斑点标准物质在实验室室温（23±1）℃避光条件下保存，可以判定在1a内是稳定的。目前，该标准物质的稳定性实验仍在继续监控中。

2.4 标准物质定值与不确定度评估

2.4.1 标准物质定值

本批标准物质采用八家实验室联合定值方法，结果经过柯克伦检验和格布拉斯检验，所有单元的数据均可保留并参与最终定值，每家实验室计数结果的平均值和总平均值见表4。

表2 模拟斑点标准物质短期稳定性考察结果

表3 模拟斑点标准物质稳定性检测结果（个）

表4 模拟斑点标准物质定值结果

2.4.2 标准物质定值结果不确定度评估

根据模拟斑点标准物质的定值数据，不同实验室得到的定值数据是一致的，定值过程引入的不确定度分量可以忽略不计；均匀性和稳定性考察结果表明，模拟斑点标准物质的不均匀性引入的不确定度分量和在有效期内的变动性引入的不确定度分量可以忽略不计。但是在使用过程中，可能由于使用磨损导致斑点个数减少；或者由于使用中尘埃进入导致识别时斑点个数增加。

以E9孔为例，尘埃的进入可能导致计数时增加1个模拟斑点，故由此引入的不确定度为

故模拟斑点标准物质E9孔内斑点个数的相对扩展不确定度为

模拟斑点标准物质E3、B6、G6、E9孔内斑点个数均少于E9孔内斑点个数，分布更加均匀可靠，研制和使用过程中都未出现斑点个数变化的情况，由于没有确定的不确定度评定模型，因此，其他孔位均采用E9孔内斑点个数的相对扩展不确定度0.4%（k=2），模拟斑点标准物质定值结果及不确定度见表5。

表5 模拟斑点标准物质定值结果

2.5 模拟斑点标准物质在仪器计量校准中的应用

利用研制成功的模拟斑点标准物质对斑点酶联免疫分析仪的示值误差及重复性的计量特性进行了考察，并在AID公司、CTL公司等10余台仪器上进行了实验验证，证明了方法的通用性。

2.5.1 示值误差

仪器的示值误差以斑点模拟标准物质的测量值与标准值的相对误差表示。开启仪器，按照使用说明书进行调试，进入正常工作状态，将模拟斑点标准物质放入载物仓并固定，分别对E3、B6、G6、E9孔拍照并计数，重复测量三次，记录测量值，并按照式（3）计算每个校准点的示值误差，取其绝对值最大者作为仪器的示值误差。

2.5.2 重复性

测量重复性以模拟斑点标准物质六次测量结果的相对标准偏差表示。仪器按照2.4.1的工作条件，将模拟斑点标准物质放入载物仓并固定，将模拟斑点标准物质标准值为200的G6孔拍照并计数六次，按照式（4）计算测量重复性。

式中：RSD——相对标准偏差，%；

Ni——单次测量值；

3 结语

本文中模拟斑点酶联免疫反应培养的斑点，采用AutoCAD设计模拟斑点图形，外形参照标准96孔板，外部包括上、下金属框架，内部包括白色背景纸、高透光塑料膜片和玻璃片，上、下金属框架依靠螺钉连接紧固，成功研制了模拟斑点标准物质，量值可靠，均匀性和稳定性良好。在实验室室温避光条件下保存，稳定性在1a以内，携带方便，成功应用到斑点酶联免疫分析仪的计量校准工作中，对仪器示值误差和重复性的计量特性进行实验研究，为仪器日常的校准工作以及国家计量校准规范的制定提供了实验基础。