利用同源重组技术构建Hoxa5、BMP6真核表达载体及共转染成纤维细胞表达

李 晶，张梦瑶，刘开东，柳 楠，贺建宁

(1.青岛农业大学 动物科技学院，山东 青岛 266109；2.曲阜市畜牧兽医技术服务中心，山东 曲阜 273100；3.青岛畜牧兽医研究所，山东 青岛 266121)

敖汉细毛羊是我国很早培育出的细毛羊品种，它主要分布在东北部地区，是我国最具有代表性的细毛羊之一[1]，其羊毛是纺织工业的重要原料。敖汉细毛羊毛囊的结构和特性直接决定毛发品质和商业价值[2]，毛囊拥有着相对复杂的结构，它的形成是由多种细胞来协同完成的。毛囊通过一系列的分化生长最后成为羊毛，其生长发育也有些复杂，它是由多种因子来相互调节，因此,通过研究相关因子来探讨毛囊的生长发育显得尤为重要。

Hox家族在生物体内是一类与发育调控相关十分重要的基因。Hox家族这类转录因子都是高度保守的[3]，对毛囊细胞增殖分化也起着十分重要的作用[4-5]。研究发现，在皮肤和毛囊生长发育过程中Hox家族基因起到了主导作用[6]，Hoxa5主导了皮肤细胞增殖、分化与凋亡[5]，对毛囊退行期进行了调控，并诱导了细胞分化[7]。动物形态的进化和多样性与Hox基因数目、序列及其表达方式密切相关，已有研究结果表明，当Hox家族基因发生变化时，动物在被毛生长时会表现出缺陷[8]。BMP6基因是TGF-β超家族中的一员[9-10]，TGF通路中的许多转录因子都受BMP6调控，均表现出上调和下调趋势。杨燕燕等[11]在生殖发育上对BMP6进行了研究，它控制着羊的多胎，尤其是在发情期基因表达相当明显。也有研究表明，BMPs通路中的转录组因子对毛囊发育主要表现出抑制作用，而它的下游靶标BMPRs主要表现出促进的作用[12-13]。程旭等[14]通过对铁调素在BMP6-HJV-SMAD信号通路的作用，验证了BMP6的重要性。由此可见，Hoxa5和BMP6基因都能抑制毛囊生长，但二者之间的关系鲜有报道。

对于家畜皮肤毛囊的一些研究大多集中在单个基因的功能验证上，还有一些是与骨的调节、繁殖等与皮肤毛囊无关的研究，本试验主要的侧重点是利用同源重组技术构建表达载体通过与单、共转染比较基因表达量的变化来研究Hoxa5和BMP6之间的作用关系，旨在为更深层次上研究毛囊功能基因奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

健康的30日龄胎羊由青岛畜牧所奥特种羊场提供；TRIzol、KpnⅠ、倒置显微镜、荧光定量PCR等均购自Bio-Rad公司[9]。

1.2 试验方法

1.2.1 引物设计 选取绵羊Hoxa5基因(GenBank登录号为NM-001009431.1)CDS区 和BMP6基因(GenBank登录号为NM-001110277.1)CDS区，软件导入pcDNA3.1表达载体的序列，通过Snap Gene设计Hoxa5基因和BMP6基因上下游引物，序列分别如下：

F(Hoxa5)：5′-ATGCGTTAACTCAGGAATCGGATGCATCGGTCAAGCTGGCAT-3′；R(Hoxa5)：5′-TGGCCTTAAAATCTCCGAGGAAATACTCGCTCACGCGGTAG-3′。F(BMP6)：5′-TTACGGGCATCGGTAGGGAAATTCGTATTGCATGCAAAGCT-3′；R(BMP6)：5′-TGTCCGAGACCTGCACATCCACGGCGGCCCTTCAGCATACCCCTA-3′。扩增体系：20 μL，cDNA 1 μL，上下游引物各1 μL，Mix 17 μL。

1.2.2 pcDNA3.1与Hoxa5、BMP6基因同源重组 对Hoxa5、BMP6进行切胶，用KpnⅠ对pcDNA3.1进行单酶切，体系：KpnⅠ 1 μL，pcDNA3.1 5 μL，Buffer 5 μL，ddH2O 39 μL。通过电泳对BMP6、Hoxa5基因片段及pcDNA3.1进行胶回收，SoSo连接体系：BMP6、Hoxa5基因上、下游引物各1 μL，pcDNA3.1 1 μL，SoSo 5 μL，ddH2O 3 μL，转化DH5α，过夜对菌液进行振荡培养，将菌液生长良好的送往公司进行测序[12-13]。

1.2.3 胎儿成纤维细胞培养 在细胞室将30日龄胎羊从母羊子宫内取出，先用75%的酒精对胎儿进行消毒，再用PBS将胎儿表面的酒精冲洗掉。在培养皿中用手术刀将胎儿的头部和四肢、内脏等全部剔除，只用胎羊的躯干，将其剪碎，分布在培养皿中，在每一个肌肉块上面加2滴已经预热的胎牛血清，放进CO2培养箱(37 ℃，5.0% CO2)，24 h对其进行观察并且换液[15-16]。

1.2.4 细胞转染 细胞进行传代以后，等密度再次达到95%左右时，借助转染试剂对重组的载体进行瞬时转染。取脂质体20 μL，PBS 480 μL，加入到无菌的离心管中并混匀，静置5 min。进一步进行转染，转染时分为2组，分别是共转染组和单转染组，共转染组中加入Hoxa5、BMP6质粒各20 μL，单转染组加入Hoxa5质粒40 μL或者BMP6质粒40 μL，2组均加入PBS 460 μL，具体详细操作步骤参照Lipofectamine2000说明书[17]。

1.2.5 细胞转染后的qPCR 重组载体转染成纤维细胞后需要进一步的增殖培养，当密度达到95%左右时，对成纤维细胞的RNA进行提取，并将其反转录成cDNA[18]。使用Snap Gene软件对Hoxa5、BMP6和GAPDH基因进行qPCR引物设计，序列见表1。

表1 引物信息Tab.1 Primers information

qPCR反应条件：95 ℃反应7 min；95 ℃ 40 s，60 ℃退火40 s，35个循环；72 ℃ 30 s，4 ℃保存。每组3个生物学重复，对数据利用Ct(2-ΔΔCt)公式进行计算，得出Hoxa5、BMP6的相对表达量。借助SPSS 20.0软件对数据进行差异显著性的分析，以P<0.01作为差异显著性判断标准[17]。

1.2.6 Hoxa5、BMP6蛋白表达的检测 提取成纤维细胞中的组蛋白，进行Western Blot，首先进行转膜，后进行封闭，时长2 h；进行一抗、二抗的孵育，均对抗体进行2 000倍的稀释。孵育完成后利用1∶1的曝光液进行曝光拍照[17]。

2 结果与分析

2.1 Hoxa5、BMP6基因PCR扩增

以cDNA为模板，添加引物进行PCR 扩增获取Hoxa5、BMP6基因片段。1%琼脂糖凝胶电泳结果表明(图1)，Hoxa5基因条带在图中804 bp处，BMP6基因条带在图中537 bp处，都与目的基因CDS区大小吻合，可用于后期的试验。

M.2000 Marker；1.Hoxa5基因扩增片段(804 bp)；2.BMP6基因扩增片段(537 bp)。M.2000 Marker；1.Hoxa5 product(804 bp)；2.BMP6 product(537 bp).

2.2 pcDNA3.1表达载体酶切纯化

使用KpnⅠ将pcDNA3.1表达载体从环状酶切成链状，用1%琼脂糖凝胶电泳检测是否酶切成功(图2)。1，2是对pcDNA3.1的KpnⅠ单酶切，pcDNA3.1长度为5 428 bp，图中条带所在位置约是5 428 bp，结果显示酶切完成，回收条带进行重组。

图2 pcDNA3.1载体单酶切鉴定Fig.2 Single enzyme digestion identification of pcDNA3.1 vector

2.3 pcDNA3.1表达载体的重组及鉴定

将pcDNA3.1酶切成链状后，用SoSo试剂盒将BMP6、Hoxa5分别与pcDNA3.1相连接，转化，振荡培养，进行菌液PCR验证如图3所示，在约804 bp处有明亮电泳条带，是Hoxa5基因；537 bp处的是BMP6基因。菌液测序结果用Blast进行对比，结果如图4，说明BMP6、Hoxa5没有碱基的突变，已成功的连接到pcDNA3.1载体上。将连接好的重组载体从菌液中提取出来，如图5所示，1-2为pcDNA3.1-BMP6重组质粒，大小为5 965 bp，3-4为pcDNA3.1-Hoxa5重组质粒，大小为6 232 bp，与图中条带相符。

M.2000 Marker；1，4.BMP6菌液PCR；2，3.Hoxa5菌液PCR。M.2000 Marker；1，4.BMP6 bacterial PCR；2，3. Hoxa5 bacterial PCR.

2.4 细胞培养观察

对胎儿成纤维细胞的生长情况进行观察记录(图6)，24 h能够观察到细胞已经开始贴到培养皿底部，周围也有一些漂浮的组织。培养至96 h后，密度再次达到95%左右，此时即可对原代细胞进行传代[18]。

2.5 RT-PCR检测Hoxa5、BMP6基因mRNA表达

对引物进行验证，1%琼脂糖凝胶电泳结果(图7)表明，引物扩增效果良好，没有出现二聚体等杂物，在128 bp 处的是内参基因GAPDH，在186 bp处的是Hoxa5基因，在116 bp处的是BMP6基因，综上可得引物均可用于实时荧光定量PCR试验。

图4 BMP6(上)和Hoxa5(下)表达载体菌液的测序比对Fig.4 Sequencing comparison of BMP6 (up) and Hoxa5 (down) expression vector bacilli

M.10000 Marker；1-2.pcDNA3.1-BMPR6；3-4.pcDNA3.1-Hoxa5。M. 10000 Marker；1-2. pcDNA3.1-BMPR6 recombinant plasmids；3-4. pcDNA3.1-Hoxa5 recombinant plasmids

图 8，9分别为Hoxa5、BMP6和GAPDH的qPCR过程中的扩增曲线、熔解曲线，两线效果显示均良好，在qPCR过程中没有出现非特异性产物。对2组的mRNA表达进行差异显著性分析(图10)，分析显示Hoxa5与BMP6共转染后的Hoxa5基因相对表达量极显著低于单转染(P<0.01)，而共转染后的BMP6基因相对表达量在共转染却极显著高于单转染(P<0.01)。

图6 成纤维细胞原代(左)、传代(右)培养(×100)Fig.6 Primary (left) and passage (right) culture of fibroblasts (×100)

A：M.500 Marker；1-2.内参基因GAPDH；B：M.500 Marker；1-2.目的基因BMP6；C：M.500 Marker；1-2.目的基因Hoxa5。A：M.500 Marker；1-2 .Reference gene GAPDH；B：M. 500 Marker；1-2.Target gene BMP6；C：M.500 Marker；1-2. Target gene Hoxa5.

图8 Hoxa5、BMP6和GAPDH 熔解曲线Fig.8 Hoxa5，BMP6 and GAPDH melting curves

图9 Hoxa5、BMP6和GAPDH扩增曲线 Fig.9 Hoxa5， BMP6 and GAPDH amplification curve

2.6 Hoxa5、BMP6蛋白表达的检测

对Hoxa5、BMP6基因的共转染、单转染蛋白的表达(图11)进行比较分析，从灰暗度以及条带的大小，使用ImageJ和SPSS软件进行分析，Hoxa5与BMP6共转染后的Hoxa5蛋白表达量极显著低于单转染过程(P<0.01)，而共转染的BMP6蛋白表达量却极显著高于单转染过程(P<0.01)(图12)，这与mRNA相对表达量的结果一致。

不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。图12同。Different capital letters indicate extremely significant difference(P<0.01).The same as Fig.12.

图11 Hoxa5、BMP6蛋白表达 Fig.11 Hoxa5 and BMP6 expression protein

图12 Hoxa5、BMP6蛋白相对表达量Fig.12 Relative expression of Hoxa5 and BMP6 protein

3 讨论

许多研究表明，毛囊的发育依靠一系列的信号分子，这些信号分子在真皮细胞和上皮细胞间穿梭着，介导了这2个细胞群体间的相互作用，毛囊能够稳定的进行发育全靠这两者的介导。毛囊的形成过程中离不开所谓的原始信号，此信号来源于真皮下[18]，并且在真皮下去激活Wnt信号[19-20]。目前，许多信号通路都参与毛囊的发育，最常见的有Wnt通路、FGF家族、BMP家族、TGF家族[21]等。Botchkarev等[22]利用小鼠来研究BMPs在皮肤中的表达位置以及表达时期，表明BMPs家族基因对毛囊的发育存在着一定的抑制作用。BMP6基因和BMP4一样同属于BMP家族，是一种抑制毛囊发育的信号分子，Hoxa5基因是TNF家族中尤为重要的基因，同样也是一种抑制毛囊发育的信号分子，两基因对毛囊的发育均有抑制作用[23]。在信号通路中，BMP家族中的信号分子对TNF通路中信号分子有干涉作用，有些是辅助基因的表达，有些是抑制基因的表达。现在对单个基因功能的验证普遍存在，多个基因相互作用还是尤为少见，本研究通过利用同源重组手段来验证多基因相互之间的作用，帮助筛选相关基因，有助于后期育种和羊毛生产。

为探讨Hoxa5、BMP6基因在细胞水平上是否存在互作效应，本研究利用同源重组技术，快速构建了pc-DNA3.1-Hoxa5、pc-DNA3.1-BMP6表达载体，并通过共转染、单转染后基因mRNA、蛋白表达量的比较分析，发现Hoxa5基因有促进BMP6基因表达，BMP6基因有抑制Hoxa5基因表达的现象。本研究在构建表达载体过程中所用同源重组技术较传统的T克隆技术节约了时间，减少了碱基突变；同时由分子水平到细胞水平得到了Hoxa5和BMP6基因的互作关系，一方面验证了与羊毛生长有关的基因，为信号通路的解析添加了论证，另一方面为进一步在个体水平上验证其功能奠定基础。