苯丙酮酸生物转化产物的抑菌活性研究*

冀慧颖，李雪儿，李明华

(江苏食品药品职业技术学院，江苏 淮安 223003)

随着人们健康意识的增强和对食品安全性要求的日益提高，要求以天然防腐剂取代化学防腐剂的呼声越来越强烈。微生物代谢产物作为天然防腐剂的重要来源之一，因其安全性高、抑菌谱广、生产成本低等优点而日益受到科研工作者的青睐。在众多微生物中，乳酸菌作为国际公认安全级(GRAS)微生物，其多种代谢产物在防腐行业中具有重要的应用潜力，如细菌素[1]、乳酸[2]和苯基乳酸(PLA)[3]等物质。

PLA具有安全性高、稳定性强、抗菌活性强、抗菌谱广等优点，在食品、饲料和药品行业中具有重大的应用潜力[4]。在能够合成PLA的多种乳酸菌中，乳杆菌(Lactobacillus)因易培养、合成效率高，已受到越来越多科技工作者的关注。近年来，通过对Lactobacillus发酵条件优化[5]、菌种诱变[6]、细胞透性化[7]等手段，使PLA的产量得到较大程度的提高。在本研究中，将对植物乳杆菌(L.plantarum)静息细胞催化苯丙酮酸(PPA)得到的PLA进行分析，并对其抑制细菌和霉菌的活性进行初步研究。

1 实 验

1.1 菌株与试剂

植物乳杆菌(L.plantarum)，本实验室分离保存[8]；大肠杆菌(Escherichiacoli)，金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)，扩展青霉(Penicilliumexpansum)和黄曲霉(Aspergillusflavus)菌株购于上海保藏生物技术中心。MRS培养基、LB培养基、马铃薯葡萄糖肉汤培养基(PDB)及其相应固体培养基均购于杭州微生物试剂有限公司。PPA、D-PLA和L-PLA购于阿拉丁试剂公司，其它试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

HP1100高效液相色谱仪(HPLC)，美国安捷伦；ZD85A恒温振荡器，江苏金坛；DNP-9052恒温培养箱，上海精宏；R1005旋转蒸发仪，上海越众；722G分光光度计，上海精科；AL104电子天平，上海梅特勒-托利多；MNT-150数显游标卡尺，德国美耐特。

1.3 实验方法

1.3.1 苯基乳酸生物催化制备

应用植物乳杆菌静息细胞转化PPA制备PLA[9]，转化完成后，将转化液于4 ℃、10000 rpm离心机内离心10 min后，上清液用旋转蒸发仪60 ℃下真空浓缩至原体积的十分之一，然后在浓缩液中按1∶1(v/v)比例加入乙酸乙酯萃取，将萃取液合并后加入适量Na2SO4除水，最后应用旋转蒸发仪除去乙酸乙酯即得PLA粗提物。将获得的产物用大赛璐手性柱OB-H进行检测，流动相为己烷/异丙醇/三氟乙酸(98/2/0.05)，流速为1.0 mL/min，检测波长为210 nm，柱温为25 ℃。

1.3.2 苯基乳酸最低抑菌浓度测定

采用倍半稀释法测定PLA对细菌和霉菌的最低抑制浓度(MIC)[10]。将LB培养基分装至多支试管，每支试管加培养基10 mL，然后加无菌PLA粗提物至终浓度分别为0.5～10 mg/mL，再加入50 μL细菌新鲜培养液，37 ℃、150 rpm摇床内培养18 h；将霉菌孢子加到含同等浓度PLA的PDB培养基中，使孢子浓度约1×105CFU/mL，28 ℃、150 rpm摇床内培养24 h。根据细菌和霉菌的生长情况及吸光值确定PLA的最低抑菌浓度。

1.3.3 苯基乳酸对细菌生长曲线影响的测定

根据PLA对细菌的抑菌能力，分别测定其对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌生长曲线的影响。将过滤除菌的PLA加入瓶装量为150 mL的500 mL三角瓶内，至终浓度分别为0.5 MIC和1 MIC，然后在三角瓶内接入培养至16 h的新鲜细菌种子培养液，摇匀后于摇床内37 ℃、180 rmp条件下培养至24 h，定时取样于600 nm波长下测定吸光值，绘制生长曲线。

1.3.4 苯基乳酸对霉菌孢子萌发的影响

将扩展青霉和黄曲霉分别接种于PDA培养基试管斜面上，28 ℃培养至产生大量分生孢子后，加入无菌水将分生孢子轻轻洗下，振荡均匀后用无菌水稀释至浓度为1×105CFU/mL备用。分别取0.5 mL孢子液和浓度为1 MIC和2 MIC的PLA0.5 mL混合均匀，取100 μL混合液滴于凹面载玻片，将载玻片置于培养皿内28 ℃保湿培养，直至空白对照孢子萌发率高于95%时，检查各处理孢子萌发情况，以孢子芽管长度大于孢子短半径时视为萌发[11]。显微镜下随机检查3个视野，记录孢子总数和萌发数，计算孢子萌发率。

1.3.5 苯基乳酸对霉菌菌丝生长的影响

应用菌丝生长速率法测定PLA对菌丝生长的影响[12]。制备含有不同浓度PLA的PDA固体平板，以无菌水为对照。用打孔器从培养72 h的霉菌菌落边缘取直径为5 mm的菌饼，然后菌丝面朝下接种于对照及含PLA的PDA平板中央，28 ℃培养96 h后，用十字交叉法测量菌落直径。

2 结果与讨论

2.1 苯基乳酸粗提产物的检测

PLA具有两种不同的构型，即D型和L型，其中D-PLA抑菌能力稍强。PPA经过植物乳杆菌静息细胞转化完成后，经过粗提，粗提物由手性柱进行检测，结果如图1所示。由图1可以看出，PPA转化产物分别在洗脱19.38 s和23.09 s时出现两个峰，对照标准品图谱可知，这两个峰对应的产物分别为D-PLA和L-PLA。由此可见，PPA经过植物乳杆菌转化后，产物主要为D-PLA和L-PLA，且D-PLA含量较高。

图1 苯丙酮酸植物乳杆菌转化产物的HPLC分析

2.2 苯基乳酸对细菌、霉菌的最低抑制浓度

PLA对两种细菌和霉菌的MIC如表1所示。由表1可以看出，PLA对细菌和霉菌生长均有明显的抑制能力，其中对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的MIC均为4 mg/mL，而对扩展青霉和黄曲霉的MIC分别为6 mg/mL和8 mg/mL。由表1还可以看出，PLA对供试霉菌的MIC比供试细菌高，这说明PLA对细菌生长的抑制能力要明显优于霉菌。

表1 PLA对细菌和霉菌的最低抑制浓度

2.3 苯基乳酸对细菌生长的影响

为了进一步确定PLA对细菌生长的抑制程度，分别测定了不同PLA浓度下大肠杆菌和金黄色葡萄球的生长情况，供试PLA浓度分别为0.5 MIC和1 MIC，即2 mg/mL和4 mg/mL，以无菌水做对照，结果如图2所示。由图2可知，培养基内不加PLA时，两种细菌的生长速度都较快，在培养4 h后即进入对数生长期，再培养10 h后达到稳定期，OD600分别为2.22和2.41。而培养基内存在0.5 MIC PLA时，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长均受到显著的抑制，其中对数生长期由4 h推迟到10 h，培养至24 h时，菌体浓度远远低于对照，OD600仅为1.23和1.32。当PLA浓度提高到1.0 MIC时，两种细菌几乎不生长。由此可以看出，PLA对细菌生长的抑制能力是比较强的。

图2 PLA对大肠杆菌(a)和金黄色葡萄球菌(b)生长的影响

2.4 苯基乳酸对霉菌孢子萌发及菌丝生长的影响

霉菌的繁殖可通过孢子和菌丝断裂两种方式进行，因此，实验通过测定PLA抑制孢子萌发和菌丝生长两种方式确定该物质的抗霉活性。

图3(a)表明，PLA对扩展青霉和黄曲霉分生孢子萌发均具有显著的抑制活性。在对照处理孢子萌发率大于95%时，0.5 MIC PLA处理的扩展青霉和黄曲霉分生孢子萌发率仅为43.34%和51.25%，对孢子萌发的抑制率分别达54.38%和46.05%。当将PLA浓度提高到1.0 MIC时，仅有少量孢子萌发，抑制率高达95%以上。

图3 PLA对霉菌孢子萌发(a)和菌丝生长(b)的影响

PLA对扩展青霉和黄曲霉菌丝生长也有显著的抑制活性，如图3(b)所示。在对照平板中，供试霉菌菌丝能够快速生长，培养至96 h时，菌落直径即达23～25 mm，而在含有0.5 MIC PLA的平板上，菌丝生长受到明显抑制，扩展青霉和黄曲霉菌落直径分别为16.7 mm和14.2 mm，菌丝生长抑制率分别为42.08%和49.17%，当PLA浓度提高到1.0 MIC时，对两种霉菌菌丝生长抑制率分别提高到了79.21%和85.08%。由此可以看出，PLA对霉菌菌丝生长也具有明显的抑制活性，且黄曲霉较扩展青霉对PLA更加敏感。

3 结 论

应用植物乳杆菌静息细胞，可将PPA转化为PLA，且D-PLA较L-PLA含量高。PLA能够显著抑制细菌的生长、霉菌孢子萌发，还具有较高的抑制菌丝生长的活性，展现出了较强的抗菌能力。