基于金属卟啉2DMOFs仿酶催化的过氧化氢比色法检测

谢兴钰，赵雅香，赵莉芝，李日舜，吴迪昊，叶 卉，辛清萍，李 泓，张玉忠

（天津工业大学省部共建分离膜与膜过程国家重点实验室,材料科学与工程学院,天津 300387）

过氧化氢（H2O2）作为廉价有效的氧化剂、漂白剂及防腐剂，被广泛应用于化工、航空航天、漂白杀菌、食品和医疗等领域.但过量的过氧化氢会造成环境污染，其分解生成的活性自由基会破坏细胞器、蛋白质结构，断裂DNA分子链，使生物体受到损害，并威胁人类健康［1］.因此，建立高效的过氧化氢检测方法具有重要意义.目前，常用的过氧化氢检测技术有化学滴定法［2］、比色传感法［3，4］、高效液相色谱法［5］和电化学法［6］等.其中，比色传感法具有成本低、操作简单、检测速度快且结果可视化等优点，是分析化学和环境监测领域常用的检测手段［7］.比色传感法通常是在过氧化氢的氧化作用下，利用底物光学性质（吸收或发射）的变化作为检测信号，从而实现对过氧化氢的检测，因此选择高效的催化剂成为关键.

过氧化物酶是一种生物催化剂，能高效催化H2O2氧化多种底物［8，9］.然而，天然酶的稳定性差、成本高且不易保存，限制了其进一步应用［10］.因此，寻求成本低、稳定性好且具有天然酶特性的仿生酶成为研究热点［11］.过氧化物酶的辅基是基于铁卟啉的结构，是酶催化活性中心［12］，因此铁卟啉成为一类重要的仿生酶.但单独的铁卟啉易发生氧化降解或不可逆的聚集反应，使催化活性降低［13］.研究［14，15］发现，金属有机骨架（MOFs），尤其是具有二维结构的MOFs纳米片，是构建铁卟啉仿生体系的理想材料之一：铁卟啉通过金属离子连接以单分子态存在，彼此互相分离，避免了聚集；与块体MOFs 材料相比，纳米片具有更大的比表面积和更多的表面活性位点，可提高其催化活性.

本文以四（4-羧苯基）铁卟啉（FeTCPP）为有机配体，铜离子为金属节点，利用溶剂热法制备了二维纳米片（Cu-FeTCPP 2DMOFs）和三维块体（Cu-FeTCPP 3DMOFs）金属有机骨架材料，通过催化氧化反应证明了其仿过氧化物酶活性；利用Cu-FeTCPP 2DMOFs 纳米片与色源底物3，3′，5，5′-四甲基联苯胺（TMB）构建了过氧化氢比色传感检测体系，在较宽的浓度范围内表现出良好的线性关系，实现了对过氧化氢的微量检测.

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

四（4-羧苯基）铁卟啉（FeTCPP，纯度98%）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP，Mw=40000）和三氟乙酸（纯度99%）购于北京百灵威科技有限公司；三水合硝酸铜［Cu（NO3）2·3H2O，A.R.级］，3，3′，5，5′-四甲基联苯胺（TMB，纯度99%）和过氧化氢（H2O2，质量分数为30%）购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；N，N-二甲基甲酰胺（DMF，A.R.级）和无水乙醇（A.R.级）购于天津科密欧化学试剂有限公司；实验用水均为18.2 MΩ超纯水（Milli-Q超纯水系统，美国Thermo Fisher公司）.

TU-1901型紫外-可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；SEM500型热场发射扫描电子显微镜（SEM，德国Gemini 公司）；H7650 型透射电子显微镜（TEM，日本日立公司）；Nicolet 6700 型傅里叶变换红外光谱仪（美国Thermo Electron 公司）和D8 Discover 型X 射线粉末衍射仪（德国Bruker公司）.

1.2 Cu-FeTCPP MOFs的制备

1.2.1 Cu-FeTCPP 2DMOFs 的合成 称取Cu（NO3）2·3H2O（0.01 mmol）和 PVP（10.0 mg）溶解于 12 mL DMF和无水乙醇的混合液（体积比3∶1）中，记为溶液I.取FeTCPP（0.005 mmol）溶于4 mL DMF和无水乙醇混合液中，记为溶液Ⅱ.将溶液Ⅱ滴加到溶液I中，随后加入20 μL 1.0 mol/L三氟乙酸.在80 ℃下反应3 h后，加入适量无水乙醇，在8000 r/min转速下离心10 min，得到Cu-FeTCPP 2DMOFs纳米片，用乙醇重复洗涤3次后，分散在乙醇中保存［16］.

1.2.2 Cu-FeTCPP 3DMOFs 的合成 与上述二维纳米片的合成过程类似，将Cu（NO3）2·3H2O（0.02 mmol），FeTCPP（0.01 mmol）及20 μL 1.0 mol/L 三氟乙酸溶解于2 mL DMF 和无水乙醇的混合液（体积比3∶1）中，于80 ℃反应24 h 后，加入适量无水乙醇，在8000 r/min 转速下离心10 min，得到Cu-FeTCPP 3DMOFs，用乙醇重复洗涤3次后，分散在乙醇中保存［16］.

1.2.3 Cu-FeTCPP MOFs 的结构分析 利用 SEM 和 TEM 观察了 Cu-FeTCPP 2DMOFs 和 3DMOFs 的形貌，采用 XRD 分析了 2 种 MOFs 的晶体结构；用 FTIR 分析 2 种 MOFs 的化学结构，并与 Cu（NO3）2·3H2O，PVP 及 PVP/Cu（NO3）2·3H2O 作对比，其中 PVP/Cu（NO3）2·3H2O 为 Cu（NO3）2·3H2O 和 PVP 的混合物，通过二者混合溶液冷冻干燥后制得.

1.2.4 Cu-FeTCPP MOFs 溶液浓度的计算 Cu-FeTCPP MOFs 溶液的浓度以骨架中FeTCPP 单元的摩尔浓度来表示.首先以乙醇为溶剂建立FeTCPP 标准曲线，根据朗伯-比尔定律计算出摩尔吸光系数为ε415=1.09×105L·mol-1·cm-1；然后测定合成Cu-FeTCPP MOFs 后离心所得上层清液在 415 nm 处的吸光度，计算未参与反应的FeTCPP的量，结合MOFs合成时FeTCPP的总量及所配制Cu-FeTCPP MOFs溶液的体积计算MOFs的浓度.

1.3 过氧化氢检测条件的优化

在TMB溶液中依次加入Cu-FeTCPP MOFs和H2O2溶液，显色10 min后，测试溶液的紫外-可见吸收光谱，分析Cu-FeTCPP MOFs对显色反应的催化作用，样品分别记为TMB+H2O2+2DMOFs和TMB+H2O2+3DMOFs.对照实验中，在TMB 溶液中仅加入Cu-FeTCPP 2DMOFs 或H2O2溶液，样品分别记为TMB+2DMOFs和TMB+H2O2.

根据Cu-FeTCPP MOFs 催化H2O2氧化TMB 发生显色反应来实现对H2O2的检测.对不同温度（20～45 ℃）、溶液pH（0.1 mol/L 醋酸缓冲溶液，pH=3.0～5.8）、催化剂浓度（3～47 μmol/L）和TMB 浓度（0.03～0.45 mmol/L）等实验参数进行了优化；然后在最佳条件下对比了2种MOFs及FeTCPP的催化活性，并建立H2O2的比色检测方法.

1.4 标准检测曲线的绘制

以pH=3.7的0.1 mol/L醋酸缓冲液为溶剂，配制系列浓度的H2O2的标准溶液.将H2O2标准溶液加入到含有TMB和Cu-FeTCPP 2DMOFs纳米片的溶液中，最终混合溶液中的H2O2浓度为3～1000 μmol/L，TMB浓度为0.12 mmol/L，Cu-FeTCPP 2DMOFs纳米片浓度为30 μmol/L.待混合溶液显色10 min后，测定其在650 nm处的吸光度，根据吸光度值与H2O2溶液的浓度建立标准曲线.

(3)对于过程中产生的有机硫，应优化各级催化剂组合方式，在硫磺回收单元不断叠加水解，同时通过控制工艺条件，避免生成新的有机硫，控制克劳斯尾气中的有机硫含量，最后保持加氢水解单元高效转化，可将进入灼烧炉的有机硫含量降至最低。

1.5 自来水中过氧化氢的比色传感检测

取自来水作为过氧化氢检测的实际水样，将其作为溶剂制备H2O2的加标样品，然后将加标样品加入到含有TMB 和Cu-FeTCPP 2DMOFs纳米片的醋酸缓冲溶液（pH=3.7）中，最终混合溶液中的TMB浓度为0.12 mmol/L，Cu-FeTCPP 2DMOFs纳米片浓度为30 μmol/L，H2O2浓度分别为10，20和40 μmol/L.显色10 min后，测定反应液在650 nm处的吸光度值.

2 结果与讨论

2.1 Cu-FeTCPP MOFs的制备与表征

Cu-FeTCPP MOFs 形成过程中，每个FeTCPP 配体与4 个双核轮桨式次级结构单元［Cu2（COO）4］首尾连接，形成二维的层状结构，而片层间的进一步堆叠会导致晶体各向同性增长，形成三维块体结构（Cu-FeTCPP 3DMOFs）（见Scheme 1）.采用表面活性剂辅助合成二维纳米片时，表面活性剂附着在MOFs 表面，阻碍了片层间的进一步堆叠，晶体各向异性生长，最终获得超薄的纳米片层状结构（Cu-FeTCPP 2DMOFs）.

通过SEM 和TEM 探究了Cu-FeTCPP MOFs 的结构与形貌，可见Cu-FeTCPP 3DMOFs 呈现块状，表现出明显的不规则片层堆积结构［图1（A）］，而Cu-FeTCPP 2DMOFs 呈片层结构［图1（B）和（C）］，边缘具有自发卷曲的趋势.从图1（D）所示TEM照片可以观察到CuTCPP 2DMOFs超薄的二维结构，且呈现出褶皱特点，因此其比表面积更大.由BET 测试结果可知，Cu-FeTCPP 3DMOF 的比表面积为20.127 m2/g，而2DMOF纳米片的比表面积为36.284 m2/g，这将有利于其在催化反应中提供更多的活性位点.

Fig.1 SEM image(A) of Cu-FeTCPP 3DMOFs and SEM(B) and TEM images(C, D) of Cu-FeTCPP 2DMOFs nanosheets

由图2（A）所示XRD谱图可见，Cu-FeTCPP 3DMOFs在2θ=7.6°，9°和19.2°处出现特征峰，可分别归属于MOFs的（110），（002）和（004）晶面，表明金属卟啉形成了结晶MOFs结构［16］.CuTCPP 2DMOF纳米片的XRD谱图与块体的主体结构基本一致，表明了2种MOFs骨架的晶体结构相同，但2DMOFs的衍射峰偏弱，这可能是由于表面活性剂PVP的存在所致.

Fig.2 XRD patterns(A)and FTIR spectra(B)of different samples

图2（B）为 Cu-FeTCPP MOFs 及原料 Cu（NO3）2·3H2O 和 PVP 的 FTIR 谱图.可见，Cu-FeTCPP 2DMOFs 纳米片［图2（B）谱线a］在1286 cm-1出现了C—N 的伸缩振动峰，而在3DMOFs 的FTIR 谱线［图2（B）谱线b］上则观察不到C—N伸缩振动峰，表明PVP附着在2DMOFs纳米片表面；并且与纯PVP［图2（B）谱线d］的C—N 伸缩振动峰1290 cm-1相比，该吸收峰出现了红移，进一步证明PVP 与Cu-FeTCPP 2DMOF纳米片之间存在相互作用.由于PVP与FeTCPP均含有C=O官能团，难以辨别PVP附着在纳米片上C=O伸缩振动峰的偏移现象，所以通过PVP与Cu（NO3）2·3H2O混合物的FTIR谱图来分析PVP 与Cu2+的相互作用.由图2（B）谱线c可见，两者混合之后，PVP 的C=O 伸缩振动峰从1650 cm-1移至1610 cm-1处，表明PVP上吡咯环中的C=O基团与金属Cu2+之间发生了较强的配位作用.FTIR光谱分析结果表明，表面活性剂PVP 与金属Cu2+之间的配位作用使其在晶体生长过程中附着于MOFs表面，导致晶体各向异性增长，这也是PVP常被用作2DMOFs结构控制剂的原因.

2.2 Cu-FeTCPP MOFs的仿酶催化活性

在H2O2氧化下，无色的TMB可生成亚胺自由基阳离子的氧化产物，进而与母体化合物形成蓝色电荷转移复合物［17］，其显色机理如Scheme 2所示.基于此，可以利用TMB溶液的显色程度来评价催化剂的仿酶催化活性.

Scheme 2 Scheme of colorimetric mechanism of Cu-FeTCPP MOFs catalyzed reactions

不同体系的紫外-可见光谱及溶液颜色如图3 所示，可见，仅氧化剂H2O2或催化剂Cu-FeTCPP MOFs存在时，TMB均无显色，在500～800 nm波长范围内无明显吸收峰［图3（A）谱线b和c］.而当二者同时存在时，体系在650 nm处出现强吸收峰［图3（A）谱线d和e］，溶液呈蓝色［图3（B）右侧照片］，表明TMB被氧化为电荷转移复合物，Cu-FeTCPP MOFs具有仿过氧化物酶活性.Cu-FeTCPP MOFs的催化特性主要归功于其骨架中铁卟啉的结构，因此本文以FeTCPP 为基元来计算仿酶催化剂的浓度，便于进行催化活性的比较.由图3（A）可见，当催化剂浓度相同时，Cu-FeTCPP 2DMOFs催化得到的氧化产物的特征吸收峰比3DMOFs的强，表明纳米片的仿酶催化能力优于三维块体，这是由于二维纳米片的比表面积更大，在催化过程中暴露的活性位点更多.

Fig.3 UV-Vis absorption spectra(A) of TMB(a), TMB+H2O2(b), TMB+2DMOFs(c), TMB+H2O2+3DMOFs(d),TMB+H2O2+2DMOFs(e)and visual color image(B)

Cu-FeTCPP MOFs的水溶液呈浅橙色［图3（B）中间照片］，其吸收峰位于429 nm处，而650 nm处的吸光度非常低，当浓度为30 μmol/L时，吸光度值小于0.015［图3（A）谱线c］，因此对TMB蓝色氧化产物吸光度的检测及对溶液颜色的观察均影响不大.故Cu-FeTCPP 2DMOFs可作为有效的过氧化物模拟酶，用于H2O2的比色传感检测.

2.3 检测条件的优化

仿酶的催化活性通常依赖于溶液pH值、检测温度、TMB 浓度和催化剂浓度，为了能够得到最佳的检测效果，以Cu-FeTCPP 2DMOFs为催化剂，对上述因素进行了优化.

由图4（A）可知，随着pH值的增大，反应体系在650 nm处的吸光度值先增大后减小，当pH=3.7时对应的吸光度值最大，即在此条件下显色最明显，酶促反应效率最高.温度对显色过程的影响相对较小，在25 ℃时显色吸光度值最大.

图4（B）示出了体系在650 nm 处的吸光度随TMB 浓度变化的结果，可见，随着TMB 浓度增大，体系的吸光度先呈线性增大趋势，当TMB浓度大于0.15 mmol/L后，吸光度变化趋于平缓，表明此时底物TMB过量，氧化产物浓度不再增加.Cu-FeTCPP 2DMOF催化剂浓度的优化结果如图4（C）所示，可见催化剂浓度的增加导致体系在650 nm的吸光度呈线性上升，这是由于催化剂浓度增加使催化活性位点增多，进而加快了TMB的氧化.由图4（D）中还可见，当催化剂浓度过高时，体系在650 nm处的吸收峰并未增强，且体系开始生成450 nm左右的黄色产物二亚胺（Scheme 2）.为避免显色的干扰因素，催化剂浓度应不高于30 μmol/L.

2.4 Cu-FeTCPP 2DMOFs仿酶活性的动力学分析

为了进一步确定Cu-FeTCPP 2DMOFs 的仿过氧化物酶活性，对其进行了稳态酶促反应动力学分析.动力学参数由米氏方程（Michaelis Menten equation）得出［18］：

式中：v为初始反应速度（mol·L-1·s-1）；vmax为最大反应速度（mol·L-1·s-1）；［S］为底物（TMB或H2O2）浓度（mol/L）；Km为米氏常数（mol/L）.Km值为反应速度等于最大反应速度的一半时底物的浓度，是酶的特征常数，Km值越低表明酶与底物的结合亲和力越大，达到最大酶促反应速率所需的底物浓度越低，即酶的活性更高.

Fig.4 Absorbance of reaction solutions at 650 nm at different pH and temperatures(A), different concentrations of TMB(cH2O2=1 mmol/L, c2DMOFs=30 μmol/L)(B) and different concentrations of Cu-FeTCPP 2DMOFs(cH2O2=1 mmol/L, cTMB=0.12 mmol/L)(C), and UV-Vis absorption spectra of reaction solutions at different concentrations of Cu-FeTCPP 2DMOFs(cH2O2=1 mmol/L,cTMB=0.12 mmol/L)(D)

为便于计算对米氏方程两侧均取倒数，则得到Lineweaver Burk直线方程式［19］：

采用优化后的反应条件进行了稳态动力学分析，即在pH=3.7，Cu-FeTCPP 2DMOFs催化剂浓度为30 μmol/L 的条件下，分别改变底物TMB（0.03～0.15 mmol/L）与H2O2（0.4～1 mmol/L）浓度，记录反应5 min内体系的吸光度变化，根据吸光度曲线斜率及朗伯比尔定律计算初始反应速率，代入米氏方程由双倒数作图法（图5）计算得到Km与vmax.同时，以Cu-FeTCPP 3DMOFs和游离的FeTCPP为催化剂，在相同条件下作对照实验.表1列出了这3种催化剂以及基于MOFs的其它仿酶材料的动力学参数，对比可知，无论是以H2O2为底物还是TMB为底物，本文中Cu-FeTCPP MOFs催化得到的Km值均比游离FeTCPP的低，表明FeTCPP与铜离子形成MOFs结构后对底物的亲和力增加，仿酶催化活性增大.而具有相同骨架结构的二维纳米片较三维块体的Km值更低，进一步表明Cu-FeTCPP 2DMOFs 纳米片催化活性更高.与文献［20，21］报道的参数相比，Cu-FeTCPP 2DMOFs也表现出更低的Km值，甚至低于过氧化物酶（HRP）的Km值，因此其具有更高的催化活性，在H2O2的比色传感检测中可以代替天然酶.

2.5 过氧化氢的比色传感检测

基于Cu-FeTCPP 2DMOFs 纳米片良好的仿酶性质，构建了H2O2的比色传感检测平台.图6（A）和（B）分别示出了最优的检测条件下，在650 nm 处TMB 的吸光度-H2O2浓度的线性拟合曲线及显色结果.可见，在3～1000 μmol/L 的H2O2浓度范围内，吸收峰的强度随着H2O2浓度的增大而升高，表现出良好的线性关系，相关系数R2=0.9991.根据信噪比公式［23］（S/N>3）计算出检出限（LOD）为2.08 μmol/L.与文献［24～27］报道的仿酶构建的H2O2传感检测参数（表2）相比，Cu-FeTCPP 2DMOFs/TMB比色传感检测体系展现出较高灵敏度以及更宽的线性范围，在水体过氧化氢定量检测中具有良好的应用前景.

Fig.5 Steady-state kinetic analysis using Michaelis Menten model(A,B)and Lineweaver Burk model(C,D)for Cu-FeTCPP 2DMOFs by varying the concentrations of H2O2(A,C)and TMB(B,D)

Table 1 Kinetic parameters of enzymatic reactions catalyzed by Cu-FeTCPP MOFs, FeTCPP and other MOFs-based peroxidase mimetics

Fig.6 Linear calibration plot between the absorbance at 650 nm and the concentration of H2O2(A)and visual color response of TMB to different concentrations of H2O2(B)

Table 2 Comparison of available methods for H2O2 colorimetric detection based onenzyme mimic of MOFs

由于过氧化氢在工业、医疗和食品等领域中的应用广泛，导致其极易通过污水排放等途径污染水环境，因此评估该比色传感体系在实际水环境中的检测性能具有重要意义.由于采集于实验室水龙头的自来水中过氧化氢的浓度太低，实验采用加标回收法进行检测.在水样中分别加入浓度为10.0，20.0，40.0 和80.0 μmol/L 的H2O2制备模拟水样，在最佳检测条件下重复测定3 次，结果如表3 所示.通过计算得出H2O2的平均回收率在97.3%～105.4%之间，相对标准偏差RSD<2.53%，表明该比色传感方法具有良好的再现性和精密度，可用于实际水样中H2O2的检测.

Table 3 Spiked recoveries of detecting H2O2 in tap water samples(n=3)

3 结 论

利用表面活性剂辅助的方法合成了Cu-FeTCPP 2DMOFs二维超薄纳米片，与三维块体3DMOFs相比，该纳米片比表面积大、活性位点可及性高，在催化H2O2氧化TMB的显色反应中，表现出更优异的仿过氧化物酶活性.基于Cu-FeTCPP 2DMOFs的仿酶催化性质，根据TMB显色产物的吸光度与H2O2浓度之间的关系建立了H2O2的比色检测方法，在H2O2浓度为3～1000 μmol/L范围内具有良好的线性关系（R2=0.9991），检出限为2.08 μmol/L，可有效检测水中H2O2含量.