菜用黄麻叶中总多酚提取及抗氧化活性研究

张浪，刘亮亮，黄思齐，李德芳

（中国农业科学院麻类研究所，湖南长沙410205）

黄麻（Corchorus capsularis L）属锦葵科黄麻属，一年生草本植物。黄麻可以作为蔬菜食用，有“帝王菜”之称。研究［1］发现，黄麻叶中含有三萜、甾体、多酚、有机酸、生物碱和微量元素等物质。文献报道［2］食用黄麻叶有健脾胃、润肠通便、降血压等诸多功效。因此，优化黄麻叶中总多酚提取工艺及其抗氧化活性研究对进一步开发黄麻产品具有促进作用。中国种植黄麻历史悠久，早在北宋《图经本草》（公元1061年）中就有黄麻形态的简要描述［3］。王群等［4］研究表明，黄麻纤维中抑菌的主要成分为三萜及甾体类。陈如冰等［5］采用超声波法对长朔黄麻中总黄酮提取工艺进行优化，发现长朔黄麻提取液对羟基自由基和超氧阴离子自由基有一定清除作用。罗玉芳等［6］研究超声波辅助提取菜用黄麻色素的工艺条件，发现色素具有一定抗氧化作用和超氧自由基清除能力。黄麻叶中虽含有众多有效成分，但目前对黄麻叶中多酚类化合物提取工艺及其抗氧化性研究鲜有报道。为此，本文以烘干菜用黄麻叶粉末为试验材料，采用响应面法探究黄麻叶中总多酚提取最优条件，考察反应时间、反应温度、液料比、乙醇体积分数对黄麻叶中总多酚提取量的影响，此外对黄麻提取液1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS）和铁离子还原/抗氧化能力（FRAP）抗氧化活性进行了研究。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

试验所用“黄麻447号”为黄麻成熟期叶片，取样于中国农业科学院麻类研究所一年生团队海南基地，选取黄麻植株顶端向下1 m叶片为试验部分。80℃烘箱中充分烘干，粉碎得到黄麻叶粉末，供后续试验用。

“黄麻447号”基本指标：粗蛋白质含量20.4 g/100.0 g，粗纤维含量41.3 g/100.0 g，绿原酸含量 0.63 mg/kg，钙 17.0 g/kg。

无水乙醇、七水合碳酸钠、抗坏血酸（Vc）（国药集团化学试剂有限公司，分析纯），Folin-Ciocalteu’s试剂（上海麦克林生化科技有限公司，分析纯），没食子酸（源叶生物有限公司，分析纯），DPPH测定抗氧化能力试剂盒、ABTS测定抗氧化试剂盒、FRAP测定抗氧化试剂盒（南京建成有限公司）。

1.2 主要仪器与设备

UV-2700紫外可见分光光度计（岛津企业管理有限公司），WEB-6多孔水浴锅（上海皓庄仪器有限公司），FZl02粉碎机（天津美斯特有限公司），KQ5200DV超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司），Allegra 64R高速冷冻离心机（北京莱伯泰科仪器股份有限公司），AL204-IC电子天平（梅特勒-托利多国际有限公司），GZX-9070鼓风干燥箱（上海博迅医疗设备厂），Kjeltec8400凯氏定氮仪（苏州安创仪器有限公司），ICE3500 AA原子吸收光谱（上海智岩科学仪器有限公司）。

1.3 试验设计

1.3.1 没食子酸标准曲线的绘制

黄麻叶中总多酚测定参考Carolina等［7］方法略有修改，配制浓度为1 mg/mL没食子酸溶液，准确移取120、150、180、210、240μL加入试管中，加超纯水至2 mL，分别移取0.2 mL Folin-Ciocalteu’s和0.8 mL 10%的碳酸钠溶液加入试管中，摇匀后黑暗环境中反应1 h，765 nm处测定没食子酸溶液OD值。

1.3.2 黄麻叶片提取液的制备及总多酚含量测定

准确称取黄麻叶粉末1.50 g于250 mL圆底烧瓶中，加入一定体积分数乙醇，冷凝回流法提取。反应结束后，将提取液转移至50 mL离心管中4000 r/min离心3 min，将离心后上清液转移至100 mL容量瓶中定容，置于4℃冰箱备用。

根据1.3.1中方法测定黄麻叶片提取液吸光值，将其代入式（3）中计算得到黄麻提取液浓度C（mg/mL），三次试验取平均值。

式中：W—总多酚提取量，mg/g；

C—样品浓度，mg/mL；

V—样品定容体积，mL；

M—样品质量，g。

1.3.3 单因素试验

按照1.3.2中方法提取黄麻叶中总多酚，单因素及水平设定如下：

乙醇体积分数：固定反应条件为液料比30∶1（mL/g），反应温度90℃，反应时间3.0 h。考察不同乙醇体积分数（30、40、50、60、70、80、90、100）对总多酚提取量的影响。

反应时间：固定反应条件为乙醇体积分数50%，液料比30∶1（mL/g），反应温度90℃。检测不同反应时间（1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0 h）对总多酚提取量的影响。

液料比：固定反应条件为乙醇体积分数50%，反应时间2.5 h，反应温度90℃。考察不同液料比（10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1）（mL/g）对总多酚提取量的影响。

反应温度：固定反应条件为乙醇体积分数50%，反应时间2.5 h，液料比30∶1（mL/g）。考察不同反应温度（50、60、70、80、90、100℃）对总多酚提取量的影响。

1.3.4 响应面试验优化

在单因素试验的基础上，以液料比、乙醇体积分数、反应时间、反应温度为试验因素，黄麻总多酚提取量为响应值，通过Box-Behnken［8］试验进行四因素三水平的中心组合试验设计，响应面试验因素与水平见表1。

表1 响应面试验因素与水平Table 1 Factors and levels coding table of the response surface experiment

1.4 抗氧化活性试验

抗氧化活性试验采用三种不同的试剂进行体外试验，包括2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐 （ABTS）［9］，铁离子还原/抗氧化能力法（FRAP）［10］和 1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）［11］。

1.4.1 DPPH自由基清除试验

取DPPH试剂1 mg溶于20 mL无水乙醇中，充分震荡摇匀，配置成DPPH溶液。取DPPH溶液2 mL于5 mL试管中，加入无水乙醇1 mL，使其充分混合，519 nm处测定吸光值，此吸光值即为A0（A0多在0.7～0.9之间）。取DPPH溶液2 mL加入试管中，分别加入黄麻提取液20、30、40、50、60μL，加无水乙醇至3 mL，混合均匀，519 nm处测定2 min内吸光值变化，起始吸光值记为Ai，终止吸光值记为Aj。以抗坏血酸（Vc）作为阳性对照，浓度为1 mg/mL。清除率公式见式（2）：

式中：η—清除率，%；

Ai—黄麻提取液起始吸光值；

Aj—黄麻提取液终止吸光值；

A0—空白对照吸光值。

1.4.2 ABTS自由基清除试验

取10mmol/L水溶性维生素E（Trolox）溶液用超纯水稀释成0.1、0.2、0.4、0.8、1.0mmol/L浓度梯度溶液。准确移取10μL不同浓度标准Trolox溶液于96孔板中，超纯水作空白对照，再向各孔中准确移取10μL黄麻叶提取液，并加入20μL反应液和170μL ABTS工作液，平行测定三次，室温下反应6 min，405 nm处，酶标仪读取各孔OD值。

1.4.3 FRAP铁还原力试验

配制100 mmol/L硫酸亚铁（FeSO4）溶液，取 FeSO4母液用超纯水稀释至 0.10、0.20、0.25、0.50、1.00、2.00 mmol/L待用。准确移取5μL上述不同浓度FeSO4标准液、黄麻叶提取液于96孔板中，超纯水做空白对照，并向各孔板中加入180μL FRAP工作液，平行测定三次，室温下反应3～5min。593 nm处，酶标仪读取各孔OD值。

2 结果与分析

2.1 没食子酸标准曲线

没食子酸标准曲线如图1。

图1 没食子酸标准曲线Fig.1 Gallic acid standard curve

没食子酸标准曲线方程如下：

式中：x—没食子酸标准品浓度，mg/mL；

y—没食子酸标准品吸光值。

线性范围为0.075～0.450 mg/mL。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 乙醇体积分数对总多酚提取量的影响

由图2可知，乙醇体积分数在50%时有最大提取量，当乙醇体积分数超过50%时，提取量随着乙醇体积分数增加而减少。这可能是因为某些多酚的极性较大，当增大乙醇体积分数时，降低了多酚在细胞内外的交换［12］。而且乙醇体积分数过大会浪费原料，因此将乙醇体积分数控制在50%为宜。

图2 乙醇体积分数对总多酚提取量影响Fig.2 Effect of ethanol volume fraction on total polyphenol extraction

2.2.2 反应时间对总多酚提取量的影响

由图3可知，在反应时间为1.0～2.5 h时，随着反应时间增加，总多酚提取量增加，当反应时间为2.5 h时，总多酚提取量达到最大，之后随反应时间延长，总多酚提取量降低，这可能是因为多酚类物质本身具有氧化性，长时间暴露在提取液中导致部分多酚化合物发生氧化反应，使得总多酚提取量降低［13］，因此将反应时间控制在2.5 h。

图3 不同反应时间对总多酚提取量影响Fig.3 Effect of different extraction time on total polyphenol extraction

2.2.3 液料比对总多酚提取量的影响

由图4可知，在测定范围内，总多酚的提取量随液料比升高而升高。这可能是由于增加提取液体积可以增大溶剂与提取物的接触面积，有利于总多酚提取。当提取剂逐渐增多时，多余的提取剂将提取液稀释，传质速率减小，单位体积的提取剂中多酚提取量变小，并逐渐达到饱和。计算可知，当液料比为30∶1时黄麻总多酚提取量比50∶1处理仅减少了2.5%，从经济角度考虑，选择液料比为 30∶1（mL/g）为宜。

图4 不同液料比对总多酚提取量的影响Fig.4 Effect of different material ratios on total polyphenol extraction

2.2.4 反应温度对总多酚提取量的影响

由图5可知，在50～90℃之间，随着反应温度的增加，总多酚提取量随之增加。这可能是因为反应温度越高，分子平均运动速度越快，扩散速率也就越快，越有利于植物中物质的提取。在90～100℃之间，总多酚提取量呈下降趋势。这可能是由于有部分多酚类物质在高温下结构被破坏，导致多酚含量下降［14］，因此，选择反应温度90℃为宜。

图5 反应温度对总多酚提取量的影响Fig.5 Effect of extraction temperature on total polyphenol extraction

2.3 响应面试验分析

在单因素试验的基础上，以反应时间、反应温度、乙醇体积分数和液料比为自变量，黄麻提取液中总多酚提取量为响应值进行响应面试验，试验结果见表2。

表2 响应面试验条件及总多酚提取量Table 2 Response surface test conditions and total polyphenol extraction

采用Design-Expert 8.0.6软件对表2中的数据进行二次多项式逐步回归拟合分析，得二次多项式回归方程为：

式中A、B、C、D分别为反应温度、反应时间、乙醇体积分数和液料比，Y为黄麻叶中总多酚提取量。相关系数为0.8201，说明该模型拟合度良好，试验误差小，可用此模型对黄麻提取液中总多酚提取量进行分析和预测。

由表3结果显示，D、A2、C2、D2对总多酚提取量的影响极显著，交互项影响均不显著，失拟项影响不显著，说明回归方程拟合度良好，未知因素对其干扰较小。Model中p=0.0038（p＜0.05），说明选用的二次多项式模型有高度显著性，得到的回归线性方程能够反应吸光值与各因素之间的关系，各因素对吸光值影响大小顺序为：液料比（D）＞反应温度（A）＞乙醇体积分数（C）＞反应时间（B）。

表3 方差分析结果Table 3 Variance analysis results

2.4 响应面法优化提取工艺

利用Design-Expert 8.0.6软件得到二次回归方程的响应面图，以此评价试验因素之间的交互强度，以确定最优工艺参数，响应面图见图6。

图6表示因素两两之间对响应值影响大小，曲面越陡峭说明影响越大，从图中可知，液料比和乙醇体积分数交互作用对总多酚提取量影响较大，这与方差分析结果一致。经Design-Expert8.0.6软件优化得到黄麻叶总多酚最优提取工艺为：乙醇体积分数为49.80%，反应时间为2.34 h，液料比为33.93∶1（mL/g），反应温度为87.85℃，这与单因素优化结果基本一致。结合实际所需，最终确定提取工艺为：称量1.50 g黄麻叶粉末，加入45 mL的50%乙醇，90℃下提取2.5 h。

图6 各因素与总提取量之间的响应面图Fig.6 Response surface diagram between various factors and total extraction

2.5 验证实验

称取1.50 g黄麻样品，按照响应面最优提取条件，平行实验三次，测定总多酚提取量。三次平行实验得到黄麻总多酚提取量分别为 13.710、13.698、13.712 mg/g，平均总多酚提取量为13.707 mg/g，这与响应面预测值13.738 mg/g相对误差为0.2%，说明优化得到的提取工艺稳定、可靠。

2.6 黄麻叶片提取液抗氧化试验结果

2.6.1 DPPH自由基清除试验

由式（2）计算得各浓度下清除率，以浓度为横坐标，清除率为纵坐标，如图7、8所示。

黄麻提取液DPPH抗氧化能力曲线方程为：

式中：x—黄麻提取液浓度，μg/mL；

y—黄麻提取液清除率，%。

相关系数为：0.984。

Vc标准样品中，DPPH抗氧化能力曲线方程为：

式中：x—Vc标准品浓度，μg/mL；

y—Vc清除率，%。

线性范围为0.36～1.80μg/mL，相关系数为0.946。根据式（5）得到黄麻提取液DPPH的IC50为2.017μg/mL，根据式（6）得到Vc标准品的IC50为0.773μg/mL，计算可知黄麻提取液DPPH自由基清除效率约为等浓度下Vc的38.32%。

图7 黄麻提取液DPPH抗氧化能力曲线Fig.7 DPPH antioxidant capacity curve of jute extract

图8 Vc阳性对照DPPH抗氧化能力曲线Fig.8 Vc positive control DPPH antioxidant capacity curve

2.6.2 ABTS自由基阳离子抑制抗氧化试验

在ABTS自由基清除试验中，以Trolox为标准品，测定吸光值为横坐标，浓度为纵坐标，如图9所示，得到线性方程为：

式中：x—Trolox标准品吸光值；

y—Trolox标准品浓度，mmol/L。

线性范围为0.1～1.0 mmol/L，相关系数为0.9918。将黄麻提取液吸光值代入式（7）中得到y=0.6673 mmol/L，因此黄麻提取液总抗氧化能力与0.6673 mmol/L的Trolox溶液相当。

图9 Trolox标准品标准曲线Fig.9 Trolox standard sample standard curve

2.6.3 FRAP总抗氧化能力试验

酶标仪读取各孔吸光值，以标准品吸光值为横坐标，标准品浓度为纵坐标绘制标准曲线，如图10所示，得到线性方程为：

式中：x—FeSO4标准品吸光值；

y—FeSO4标准品浓度，mmol/L。

线性范围为0.1～2.0 mmol/L，相关系数为0.9980。三次平行实验黄麻提取液吸光值代入方程计算得到y=1.956、1.938、1.968 mmol/L，取平均值为1.954 mmol/L，因此黄麻提取液的抗氧化能力与1.954 mmol/L FeSO4的抗氧化能力相当。

图10 FeSO4标准品曲线Fig.10 FeSO4 standard curve

3 结论与讨论

本试验采用冷凝回流法提取菜用黄麻叶中总多酚，响应面法得到黄麻叶中总多酚最佳提取工艺为：乙醇体积分数50%，液料比为30∶1（mL/g），反应温度90℃，反应时间2.5 h。验证实验结果表明，优化的结果稳定、可靠，为黄麻叶中总多酚的后续开发和提取等研究提供了参考。在黄麻叶提取液抗氧化试验中，DPPH清除自由基能力约为阳性对照Vc的38.32%，ABTS清除自由基能力相当于0.6673 mmol/L的Trolox标准品，FRAP试验中抗氧化能力与1.954 mmol/L FeSO4的抗氧化能力相当。

黄麻中含有多种有效成分，尤其是多酚类化合物，多个酚羟基的存在能够结合大量有机体产生的自由基而生成羟基自由基，使机体免于自由基的伤害。虽然黄麻在中国古代就有食用的记载，但如今黄麻却并不被人们所熟知。因此，探究黄麻中多酚最佳提取条件能为黄麻进一步开发利用提供一定技术支持。目前多利用超声波法提取黄麻中总多酚，虽然该方法简单易操作，提取时间也较短，但是超声提取重复性较低。罗玉芳等［6］利用超声法提取菜用黄麻色素，所用液料比为80∶1（mL/g），相比于冷凝回流提取法，超声提取所用溶剂量偏大，易造成浪费。杜彬等［15］在优化板栗花中多酚提取工艺时指出，液料比是影响多酚提取的关键因素，这与本试验研究结果一致。同时我们发现在提取菜用黄麻总多酚时，不同多酚之间的极性差异会导致总多酚提取量有所不同，这需要研究有机溶剂最佳体积分数，来获得最大总多酚提取量。黄麻中多酚种类较多，对于其中何种多酚具有抗氧化活性还有待进一步研究。冷凝回流提取法也存在一些不足之处，如提取时间过长导致能源浪费，而且要达到较大提取量还需进行多次提取，这给提取操作带来了一定困难。