贵州羊肚菌的分子系统发育分析

李银双 刘作易 谭玉梅 任锡毅 刘永翔 黄永会

摘 要：本研究以贵州省贵阳市、六盘水、遵义和铜仁等地采集的羊肚菌样本中挑选出24份子实体样本，采用五个基因片段（ITS、LSU、EF1-a、RPB1、RPB2）联合分析，结合子实体形态特征对其进行了物种鉴定。研究结果表明：贵州省境内共分布有8个野生羊肚菌物种，包括黑色羊肚菌和黄色羊肚菌两个类群，黑色羊肚菌有梯棱羊肚菌（M. importuna）、Mel-19、Mel-21，黄色羊肚菌有Mes-15、Mes-19、Mes-22、Mes-23、Mes-27。野生羊肚菌的发生时间为3—5月，具有喜湿喜阴的生长特性，Mes-15是首次报道具有火烧地偏好性的黄色种。

关键词：贵州;野生羊肚菌;系统发育;多基因联合

中图分类号：Q-9文献标识码：A

文章编号：1008-0457（2020）03-0052-09 国际DOI编码：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2020.03.009

Molecular Phylogenetic Analysis of Morchella in Guizhou

LI Yinshuang.1，3 ， LIU Zuoyi.4* ， TAN Yumei.2，3 ， REN Xiyi.2，3 ， LIU Yongxiang.2，3 ，HUANG Yonghui.2，3

（1. College of Life Sciences， Guizhou University， Guiyang， Guizhou 550025， China; 2. Institute of Biotechnology， Guizhou Academy of Agricultural Sciences， Guiyang， Guizhou 550006， China; 3. Guizhou Key Laboratory of Agricultural Biotechnology， Guiyang， Guizhou 550006， China;4. Guizhou Academy of Agricultural Sciences， Guiyang， Guizhou 550006， China）

Abstract：Combined with morphological characteristics of fruiting body of Morchella， 24 samples collected from Guiyang， Liupanshui， Zunyi and Tongren regions ， Guizhou Province were identified using five gene fragments （ITS， LSU， EF1-a， RPB1， RPB2） . The results showed that there existed 8 wild Morchella species in Guizhou Province， including two groups of black and yellow Morchella. Black morel are M. importuna， Mel-19， Mel-21， and yellow one containing Mes-15， Mes-19， Mes-22， Mes-23， Mes-27. The occurrence of wild morels in Guizhou was from March to May and the species prefered moisture and shade. Mes-15 was first reported to prefer to growing in burnt land.

Keywords：Guizhou; wild morel; phylogeny; multigene combination

羊肚菌（Morchella）隸属于子囊菌亚门（Ascomycotina）、盘菌纲（Discomycetes）、盘菌目（Ezizales）、羊肚菌科（Morchellaceae）[1]。作为一种世界公认的珍稀食药用菌，羊肚菌不仅味道鲜美，而且对降血脂、调节机体免疫力、抗疲劳、抗菌、抗病毒、抑制肿瘤、减轻放化疗引起的毒副作用等具有显著功效[2-3]。在羊肚菌的分类研究早期，有学者依据羊肚菌子实体形状、大小、颜色、脉棱分布和凹坑深浅等形态特征将羊肚菌属划分为四大类群（黑色羊肚菌类群、黄色羊肚菌类群、半开羊肚菌类群和变红羊肚菌类群）[4-6]。然而，世界范围内羊肚菌属的形态学分类一直存在较大争议[7-9]。随着分子生物学技术在羊肚菌属分类研究中的引入，特别是多基因谱系一致性系统发育学物种识别法（genealogical concordance phylogenetic species recognition，GCPSR）的应用，为羊肚菌属的分类研究带来了革命性的变革[8，10]。2011年，ODONNELL等[11]首次利用4个基因（LSU、EF1-a、RPB1、RPB2）联合的方法对羊肚菌属进行了系统发育分析，认为羊肚菌属是由黑色羊肚菌支系（Elata Clade）、黄色羊肚菌支系（Esculenta Clade）、变红羊肚菌支系（Rufobrunnea Clade）三个支系构成，将基于形态学鉴定的“半开羊肚菌”划分到黑色羊肚菌支系中，提出采用所在类群缩写+数字的方法来进行羊肚菌属内物种命名（Esculenta支系：Mes-n;Elata支系：Mel-n），该研究很好的规避了羊肚菌分类过程中的主观性影响，解决了羊肚菌属分类研究中的诸多争议。已有研究证明，羊肚菌属内一共包括61个系统发育物种[12]。目前，部分黑色支系羊肚菌物种在我国已经成功实现了人工栽培，但生产中使用的栽培菌种主要来自野生子实体的人工分离驯化，因此，分离菌株的准确鉴定已成为羊肚菌栽培成功与否的关键[8，13-14]。

贵州温润多雨的气候条件孕育了丰富的野生羊肚菌资源。然而，有关贵州野生羊肚菌资源的种类、分布、生境等调查研究相对较少。在《贵州大型真菌资源》一书中记录有两种羊肚菌，分别为尖顶羊肚菌（Morchella conica）和羊肚菌（Morchella esculenta）[15] 。汪建文等[16]基于对现有资料整理与调查认为贵州分布有6个羊肚菌物种，分别为黑脉羊肚菌（Morchella angusticeps）、尖顶羊肚菌（Morchella conica）、粗柄羊肚菌（Morchella crassipes）、羊肚菌（Morchella eseulenta）、高羊肚菌（Morchella elata）、普通羊肚菌（Morchella vulgris）。但是，无论2种或者6种，这些调查研究仍停留在形态学水平，没有采用分子系统学的方法对其进行物种鉴定，并且对贵州地区野生羊肚菌的地域分布、发生时间和生活环境等也没有进行过深入研究。基于以上分析，本研究在2018—2019年期间对贵阳市、六盘水、遵义和铜仁等地区开展野生羊肚菌采集工作，系统调查了贵州当地野生羊肚菌的发生时间与物种分布地域情况，同时，采用五个基因（ITS、LSU、EF1-a、RPB1、RPB2）联合分析的方法对采集样本进行了种类鉴定和物种多样性分析，进而为野生羊肚菌的栽培驯化、杂交育种与长期保护利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 样本及培养基

样本来源：2018—2019年期间，在贵州境内的贵阳、六盘水、遵义和德江等地共采集到78份野生羊肚菌子实体样本，在安顺市普定县羊肚菌栽培基地采集到2份栽培羊肚菌子实体样本。所有样本带回实验室后，自然风干-20℃保存于贵州省菌种中心。从采集样本中挑选出24份具有典型形态特征、采集时间、地域差异和涉及每个采集地点的子实体样本，编号GZCC20-0012～ GZCC20-0035，用于分子系统发育分析。24份样本的采集信息见表1。参照图书《中国大型真菌彩色图谱》[17]，初步将24份采集样本分为黑色羊肚菌和黄色羊肚菌两个类群。

1.3.4 构建多基因系统发育树

参照文献[9]对所有样本序列和参考序列作拼接处理，将样本序列和参考物种的ITS、LSU、EF1-a、RPB1、RPB2单个基因序列集合分开在Bioedit Sequence Alignment Editor（Version5.09）软件中进行Clustalw Multiple Alignment处理，所有参数均为系统默认值;删除序列两端非对位的排列序列，数据中的空位“gap”作为缺失数据“missing date”处理，保证样本和参考物种每个基因的长度一致，所得结果保存为fas格式，命名为fas1～fas5。得到ITS、LSU、EF1-a、RPB1、RPB2单个序列集合的切除拼接结果后，在Edit模式下利用Bioedit sequence Alignment Editor（Version5.09）软件将五个序列集合以“ITS+LSU+EF1-a+RPB1+RPB2”的顺序拼接起来，所得结果依然保存为fas格式，命名为fas6。五个序列集合整理过程中，同时下载基部类群变红羊肚菌（Morchella rufobrunnea）的基因序列，将其作为系统发育分析的外类群。最后，把fas6文件输入系统发育软件MEGA6.0中，选择ML法（Maximum Likehood），Bootstrap重复1000次，其他数值均为系统默认值，构建系统发育树。由系统发育结果进行物种鉴定，分析贵州野生羊肚菌的物种多样性。

1.4 形态学描述及生境分析

依据每个采集地点抽取样本的多基因分子鉴定结果，结合鉴定菌株形态特征与每份样本的采集信息，详细记录每个羊肚菌物种子实体的菌盖和菌柄大小范围、颜色深浅、楞脉分布等形态特征，记录每个物种羊肚菌子实体的生长分布方式、生长环境、分布区域等，分析贵州当地野生羊肚菌的发生时间及规律。

2 结果与分析

2.1 多基因系统发育鉴定

2.1.1 ITS、LSU、EF1-a、RPB1和RPB2扩增测序

24份样本的ITS扩增结果中，7份黑色羊肚菌样本（GZCC20-0012、GZCC20-0013、GZCC20-0020、GZCC20-0021、GZCC20-0022、GZCC20-0023、GZCC20-0035）的ITS片段长度在750 bp左右，17份黄色羊肚菌样本（GZCC20-0014、GZCC20-0015、GZCC20-0016、GZCC20-0017、GZCC20-0018、GZCC20-0019、GZCC20-0024、GZCC20-0025、GZCC20-0026、GZCC20-0027、GZCC20-0028、GZCC20-0029、GZCC20-0030、GZCC20-0031、GZCC20-0032、GZCC20-0033、GZCC20-0034）的ITS片段長度在1100bp左右，两个类群的ITS片段长度存在较大差别。其LSU片段在1100bp左右，EF1-a片段大小在1100bp左右，RPB1片段大小在750bp左右，RPB2片段在800bp左右，该四个片段大小在两个羊肚菌类群中则无明显差异。所有扩增结果送至上海生物工程有限公司进行测序。

2.1.2 ITS、LSU、EF1-a、RPB1、RPB2序列比对分析

获得所有序列信息后，切除引物片段输入NCBI blast比对分析，下载并筛选出相似性较高的羊肚菌序列作为参考序列（表2）。120条样本序列整理上传至NCBI数据库后，得到每个基因的序列登录号如表3。

2.1.3 构建多基因系统发育树

由于黄色羊肚菌类群的ITS片段较长，为保证序列中的关键分析位点不被切除，故均以变红羊肚菌（M. rufobrunnea）作为外类群，将黑色羊肚菌和黄色羊肚菌两个类群分开分析。

黑色羊肚菌类群中，所有样本序列及参考序列经过对齐处理后，ITS序列的保留长度为580bp，LSU序列的保留长度为650bp，EF1-a序列的保留长度为760bp，RPB1序列的保留长度为610bp，RPB2序列的保留长度为600bp。将所有序列按照“ITS+LSU+EF1-a+RPB1+RPB2”的顺序比对拼接后，全序列长度为3200bp，采用MEGA6.0构建系统发育树（图1）。以变红羊肚菌（Morchella rufobrunnea）作为外类群（图1），构建黑色羊肚菌类群的系统发育树后，7份黑色羊肚菌样本序列与其他参考序列被聚类在一个大的分支上。其中，GZCC20-0012、GZCC20-0013、GZCC20-0022与Mel-21以99%的Bootstrap值聚为一类;GZCC20-0023与Mel-19以100%的Bootstrap值聚为一类;GZCC20-0035与Mel-6以100%的Bootstrap值聚为一类;GZCC20-0020、GZCC20-0021与Mel-10以100%的Bootstrap值聚为一类。而梯棱羊肚菌（M. importuna）、六妹羊肚菌（M. sextelata）对应的系统发育物种分别是Mel-10和Mel-6。由此可知，黑色羊肚菌类群由Mel-21、Mel-19、梯棱羊肚菌（M. importuna）、六妹羊肚菌（M. sextelata）四個物种构成。其中，鉴定为六妹羊肚菌（M. sextelata）的GZCC20-0035为栽培样本。

黄色羊肚菌类群中，所有样本序列及参考序列经过对齐处理后，ITS序列的保留长度为860bp，LSU序列为550bp，EF1-a序列为800bp，RPB1序列为600bp，RPB2序列为655bp。将所有序列按照“ITS+LSU+EF1-a+RPB1+RPB2”的顺序拼接后，全序列长度为3465bp，采用MEGA6.0构建系统发育树（图2）。以变红羊肚菌（Morchella rufobrunnea）作为外类群（图2），构建黄色羊肚菌类群的系统发育树后，17份黄色羊肚菌样本序列与其他参考序列被聚类在一个大的分支上。其中，GZCC20-0014、GZCC20-0018、GZCC20-0017、GZCC20-0016、GZCC20-0015、GZCC20-0019、GZCC20-0025、GZCC20-0029与Mes-15以98%的Bootstrap值聚为一类，GZCC20-0015和GZCC20-0016亲缘性较近;GZCC20-0026、GZCC20-0027、GZCC20-0028、GZCC20-0032、GZCC20-0034与Mes-19以100%的Bootstrap值聚为一类，GZCC20-0028、GZCC20-0032、GZCC20-0034亲缘性较近;GZCC20-0030与Mes-23以100%的Bootstrap值聚为一类;GZCC20-0031、GZCC20-0033与Mes-22以100%的Bootstrap值聚为一类;GZCC20-0024与Mes-27以100%的Bootstrap值聚为一类。由此可知，黄色羊肚菌类群由Mes-15、Mes-19、Mes-22、Mes-23、Mes-27五个物种构成。

2.2 形态学描述及生境分析

2.2.1 形态学描述

依据多基因分子鉴定结果，结合每份样本的采集信息，将9个羊肚菌物种的形态特征，生长分布等描述如下：

Mel-21：属黑色羊肚菌支系，单生或双生。采集时间为4月份，分布于贵阳市森林公园，六盘水市。基部土壤pH6.14～6.57，子实体周围环境潮湿，植被类型为阔叶林。菌盖圆锥形，黑色，长4.8cm～6.9cm，宽3.1cm～4.7cm，顶端或尖或钝。菌柄长2.9cm～5.1cm，粗2.1cm～3.7cm，污白色，大小均匀（图3：GZCC20-0012）。

Mel-19：属黑色羊肚菌支系，单生。采集时间为5月份，分布于遵义市务川县。基部土壤pH=6.51～6.77，子实体周围环境潮湿，分布苔藓和草类植物，植被类型为阔叶林与针叶林混交林。子实体粗壮，菌盖圆锥形，褐色、黑褐色，长5.0cm～6.7cm，宽3.7cm～4.8cm，表面表面棱脊曲折，凹坑呈不规则形状，密集形似蜂窝。菌柄长6.3cm～6.7cm，粗3.3cm～3.7cm，灰白色、灰黄色，表面平滑，与菌盖连接处较细，基部略膨大（图3：GZCC20-0023）。

梯棱羊肚菌（Mel-10）：属黑色羊肚菌支系，单生。采集时间4月份，分布于六盘水市。基部土壤pH=6.51～7.22，子实体周围环境潮湿、分布苔藓和蕨类植物，植被类型为阔叶林。菌盖圆锥形，灰色或灰褐色，长5.3cm～8.7cm，宽3.9cm～6.0cm，顶端尖，表面凹坑内部有横隔。菌柄长2.9cm～5.2cm，粗2.5～4.0cm，污白色;表面分布有分布有浅纵沟，伴有少量微绒毛和颗粒物（图3：GZCC20-0020）。

六妹羊肚菌（Mel-6）：栽培羊肚菌，属黑色羊肚菌支系，单生、双生或丛生。子实体较大，菌盖长圆锥形或长圆柱形，长6.5cm～8.2cm，宽4.4cm～6.3cm，颜色褐色、红褐色、朱砂红。菌柄长5.2cm～7.2cm，粗2.7cm～5.5cm，白色，表面分布有大量纵沟与颗粒物质，基部膨大。该种可从子实体大小和颜色上和其他物种明显区分开（图3：GZCC20-0035）。

Mes-15：属黄色羊肚菌支系，单生、双生或丛生。采集时间3月份、4月份，该种分布较广，分布于贵阳市森林公园、贵阳市花溪区、贵阳市小河区、铜仁市碧江区、铜仁市江口县。基部土壤pH=6.27～7.36。子实体周围环境潮湿、分布苔藓和草类植物，采集于阔叶林、绿化草坪。在该物种的两个采集地出现了大量出菇现象，周围伴有火烧地痕迹，推测该物具有火烧地偏好性。菌盖卵圆形、圆锥形或无规则形状，颜色黄棕色、淡黄色，长3.0cm～5.5cm，宽2.7cm～4.8cm，顶端或尖或钝，表面凹坑较深，凹坑内部有横隔。外部脉棱上分布有少量刺突，肉质特别脆，这是该种的一个显著标志。菌柄长2.3cm～6.4cm，粗1.7cm～2.9cm，颜色淡黄色，表面光滑，大小均匀（图3：GZCC20-0014）。

Mes-19：属黄色羊肚菌支系，单生。采集时间3月、4月、5月，分布于铜仁市碧江区，铜仁市江口县，铜仁市思南县。基部土壤pH=6.20～7.18，实体周围环境潮湿、分布苔藓和草类植物，采集于阔叶林、绿化草坪。菌盖近圆柱形或圆球形，形似花朵，颜色浅灰色、灰黄色，长4.0cm～5.9cm，宽3.8cm～4.2cm，表面凹坑较深，顶端圆钝。菌柄长4.5cm～5.7cm，粗2.2cm～3.5cm，颜色淡黄色，表明光滑（图3：GZCC20-0027）。

Mes-22：属黄色羊肚菌支系，单生。采集时间3月份、4月份，分布于铜仁市玉屏县，铜仁市思南县。未采集到土壤，子实体周围潮湿，分布有大量草类植物，采集于河滩草丛中。菌盖长圆锥形，颜色淡黄色、灰白色，长4.8cm～6.7cm，宽3.8cm～4.1cm，顶端或尖或钝，肉质脆，部分棱脊上分布有小裂痕。菌柄长3.7cm～5.1cm，粗1.8cm～2.9cm，颜色白色，表面光滑（图3：GZCC20-0031）。

Mes-23：属黄色羊肚菌支系，单生，双生。采集时间4月份，分布于铜仁市石阡县，基部土壤pH=6.45～7.27，子实体周围环境潮湿、分布苔藓和草类植物，植被类型为阔叶林。菌盖圆柱形、圆锥形、圆球形皆有，长4.8cm～5.7cm，宽4.2cm～4.6cm;表面凹坑较深，肉质脆，幼小时深褐色，成熟后颜色黄灰色、黄褐色;菌肉表面有少许刺突。菌柄长4.3cm～5.9cm，粗1.9cm～2.5cm，污白色、灰黄色，部分表面分布有少量颗粒物质（图3：GZCC20-0030）。

Mes-27：属黄色羊肚菌支系，单生，双生或丛生。采集时间4月份，分布于铜仁市德江县。基部土壤pH=6.50～7.51，子实体周围潮湿，分布有苔藓，植被类型为阔叶林与针叶林混交林。菌盖近卵圆锥形，表面凹坑较深，顶端或尖或钝，长4.2cm～5.7cm，宽3.6cm～4.4cm，颜色灰色、黄灰色。菌柄长4.2cm～5.0cm，粗1.9cm～2.6cm，白色、污白色，表面光滑，大小均匀（图3：GZCC20-0024）。

2.2.2 生境分析

从多基因系统发育结果与样本采集信息可知，不同羊肚菌物种在形态特征、生长分布方式和分布地域等存在较大差异。在生境上，阔叶林、混交林地、绿化草坪和河滩湿地均能采集到羊肚菌子实体，其周围一般都有苔藓或草类等禾本科植物，环境相对阴湿，表明羊肚菌具有喜湿喜阴的生长特性。测定基部土壤pH表明，羊肚菌的生长偏中性，两个类群无明显差别。由样本采集信息（表1）及其他人的经验，只在3月、4月和5月份里采集到了羊肚菌子实体，而每年的3—5月份为贵州的无霜期，大部分地区气温回升、降雨增加，推测该时间段为贵州地区野生羊肚菌子实体高发生期。值得一提的是，已有研究表明部分羊肚菌物种具有火烧地偏好性，具体表现为：在发生过火烧的林地或耕地的第一年会出现羊肚菌大量出菇的现象[11，19]。迄今為止，共发现6个（Mel-1、Mel-6、Mel-7、Mel-8、Mel-9、Mel-10）偏好火烧迹地生境物种，全为黑色支系物种[8，11]。本研究在贵阳市的两个采集地发现：黄色支系物种Mes-15子实体大量出现在上一年的火烧林地中，火烧地特征与其他报道相符[8，11，19]，表明Mes-15这一物种也具有火烧地偏好性。

3 结论与讨论

羊肚菌的形态学分类体系一直存在较大争议，分子生物学分析技术在羊肚菌属分类研究中的引入，解决了羊肚菌属分类研究中的诸多争议。然而，目前羊肚菌属内物种是根据多基因谱系进行界定的，各系统发育物种的形态学研究还不够深入，形态学记录相当有限，这给羊肚菌商品信息和科学信息的准确交流带来了很多麻烦[8，20]。本研究通过对采集样本进行形态学初步分析也发现，羊肚菌属内各系统发育物种的形态学记录非常之少，只能将采集样本初步分为黑色羊肚菌和黄色羊肚菌两个类群。

野生羊肚菌资源在我国许多省份都有分布，武冬梅[9]采用4个基因（ITS、EF1-a、RPB1、RPB2）联合的方法对我国新疆地区的野生羊肚菌分布物种进行分析，认为新疆地区共分布有7个羊肚菌物种，新增了两个中国新纪录种（Mel-2、Mes-17）。除上述报道外，国内关于我国野生羊肚菌资源分布的多基因谱系研究还不多。贵州良好的气候类型，孕育了丰富的野生羊肚菌资源。但是，以往贵州野生羊肚菌资源的调查研究，只停留在形态学水平。另外，野生羊肚菌出菇期短，分布数量有限，大量采摘导致野生资源逐渐消失，如何科学保护和利用这一野生真菌资源成为一个亟需解决的问题。本研究通过对贵州境内采集的24份羊肚菌样本进行多基因谱系分析，将所有样本鉴定为9个不同的羊肚菌物种。其中，GZCC20-0035为采自安顺市普定县的栽培样本，属于黑色羊肚菌类群中的六妹羊肚菌（M. sextelata），是目前国内主要栽培物种之一。其余23份野生羊肚菌样本鉴定为8个野生羊肚菌物种，包括黑色羊肚菌和黄色羊肚菌两个类群，其中，黑色羊肚菌有Mel-21、Mel-19、梯棱羊肚菌（M. importuna），黄色羊肚菌有Mes-15、Mes-19、Mes-22、Mes-23、Mes-27。在准确的分子鉴定的基础之上，本研究给予了每个物种正确的科学名称，纠正了以往研究中错误命名的现象，详细记录了不同物种的形态特征、分布地域、生长分布方式等。并通过样本采集信息分析，认为贵州当地野生羊肚菌的发生时间为3—5月份，生长土壤pH接近中性，具有喜湿喜阴的生长特性，首次发现Mes-15这一黄色支系物种具有火烧地偏好性。这不仅丰富了贵州真菌资源信息库，也为当地野生羊肚菌资源的长期保护利用提供了科学依据，有望下一步加快野生菌种资源的栽培驯化和良种选育工作，促进羊肚菌产业的健康长远发展。

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