Caspase抑制剂对特应性皮炎患者外周血CD4+T细胞亚群分泌细胞因子的影响

李圆圆 郝宝珍 孟云芳

1山东第一医科大学附属省立医院皮肤科，山东济南，250021；2山东省妇幼保健院，山东济南，250014

特应性皮炎(atopic dermatitis, AD)是一种反复发作并伴有剧烈瘙痒的慢性炎症性皮肤疾病。关于AD的发病机制目前尚未完全明了，T细胞介导的异常免疫反应对AD的发生发展可能起主要作用[1，2]。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cysteinylaspirate-specific proteinases, caspases)是细胞凋亡过程中的重要因子，近年发现，该家族部分成员(尤其是caspase-3及caspase-8)在T细胞活化与增殖中亦发挥重要作用[3,4]，有可能成为免疫性及炎症性疾病新的治疗方向。目前对caspase在炎症性皮肤病中的研究较少。我们既往的研究表明，广谱caspase抑制剂苄氧羧基-缬氨酰-丙氨酰-门冬氨酰氟甲基酮(N-benzyloxycarbonyl-Val-Ala-Asp-fluoromethylketone, Z-VAD-FMK)可以抑制小鼠变应性接触性皮炎[5,6]。有学者发现[7]，AD患者急性期皮损表皮角质形成细胞中caspase-3表达增加，但他们的研究结果局限在表皮内，没有观察真皮及血液内的淋巴细胞中caspases表达的情况，亦没有用caspase抑制剂进行干预并观察干预后的变化。本实验以AD患者为对象，将广谱caspase抑制剂Z-VAD-FMK与患者外周血单一核细胞(blood mononuclear cells, PBMCs)体外共培养，研究caspase抑制剂在体外对AD患者T细胞免疫异常的影响。该研究将为从阻断caspase方面来治疗包括AD在内的免疫性及炎症性皮肤病提供理论及实验依据，为研制新型抗免疫及抗炎症药物提供依据。

1 材料与方法

1.1 对象 AD患者30例，其中男17例，女13例，年龄18～65岁，平均40.6岁，所有患者均符合Williams标准。在2周内未外用糖皮质激素类药物及口服抗组胺药物，4周内未系统应用糖皮质激素或免疫抑制剂治疗。对照组30例均为本院体检的健康成人，其中男18例，女12例，年龄22～60岁，平均38.5岁，无特应性疾病病史。两组性别与年龄比较，其差异均无统计学意义。本研究通过本院伦理委员会批准，受试者均签署知情同意书。

1.2 试剂与仪器

1.2.1 主要试剂 Z-VAD-FMK购自美国Promega公司，使用时用磷酸盐缓冲液(phosphate-buffered saline, PBS)稀释。地塞米松购自美国Sigma公司，使用时用PBS稀释。佛波酯和离子霉素购自美国Alexis公司，莫能霉素购自美国Sigma公司。PE-Cy5标记的抗人CD3单抗、FITC标记的抗人CD8单抗、PE标记的同型对照IgG1单抗购自美国BD公司。PE标记的抗人γ干扰素(IFN-γ)、人白细胞介素4(IL-4)、人白细胞介素17(IL-17)单抗购自美国eBioscience公司。人IFN-γ、IL-4、IL-17 ELISA试剂盒购自美国eBioscience公司。

1.2.2 主要仪器 流式细胞仪型号为FACSCalibur，系美国BD公司产品，ELISA检测仪为美国BioTek公司产品。

1.3 方法

1.3.1 单一核细胞分离 取30例AD患者及30例健康对照肝素抗凝血5 mL，Ficoll密度梯度离心法分离PBMCs，重悬于含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培养液中，调整细胞浓度至2×106/mL。

1.3.2 流式细胞仪检测CD4+T细胞亚群 取上述PBMC悬液1 mL，接种于24孔板，加入佛波酯(终浓度50 μg/L)+离子霉素(终浓度1 mg/L)及莫能霉素(终浓度1 μmol/L)，37℃ 50 mL/L CO2培养箱中培养4 h。然后把细胞悬液移至1.5 mL离心管，1500 r/min离心5 min，弃上清，PBS溶液洗2次后进行流式细胞仪检测。由于佛波酯可以减弱CD4的表达，本实验未采用荧光素标记的CD4抗体，而用CD3+CD8-细胞群代替CD4+细胞群。

1.3.3 ELISA方法检测培养上清液中的细胞因子 取上述PBMC悬液1 mL，接种于24孔板，将30例AD患者的PBMC均分3孔，每孔均加入佛波酯(终浓度50 μg/L)+离子霉素(终浓度1 mg/L)，然后再分别加入等量的Z-VAD-FMK溶液、地塞米松溶液及PBS溶液，使Z-VAD-FMK终浓度为100 μmol/L，地塞米松终浓度为250 nmol/L。置于37℃ 50 mL/L CO2培养箱中培养24 h。然后把细胞悬液移至1.5 mL离心管，1500 r/min离心5 min，收集上清液。ELISA方法检测上清液中IFN-γ、IL-4、IL-17的浓度。

2 结果

2.1 AD患者外周血单一核细胞中Th1、Th2、Th17细胞比例 佛波酯+离子霉素刺激培养AD患者及健康对照PBMC 4 h后，用流式细胞术检测细胞膜表面标记和细胞内细胞因子。结果显示，AD患者组CD3+CD8-IFN-γ+(Th1)细胞比例低于健康对照组(P<0.01)，CD3+CD8-IL-4+(Th2)细胞比例明显高于健康对照组(P<0.01)，CD3+CD8-IL-17+(Th17)细胞比例明显高于健康对照组(P<0.01)。见表1、图1。

1a、1c、1e:AD患者；1b、1d、1f:健康对照

表1 AD患者及健康对照组外周血表达不同细胞因子的CD4+T细胞亚群水平

2.2 Z-VAD-FMK对AD患者外周血单一核细胞培养上清液IFN-γ、IL-4、IL-17的影响 AD患者PBMCs中加入佛波酯+离子霉素刺激培养，然后再分别加入等量的Z-VAD-FMK溶液(终浓度100 μmol/L)、地塞米松溶液(终浓度250 nmol/L)及PBS溶液，培养24 h，ELISA方法检测上清液中IFN-γ、IL-4、IL-17的浓度。结果显示，与PBS处理组这一阴性对照相比，Z-VAD-FMK处理组与地塞米松处理组IFN-γ、IL-4、IL-17水平均显著降低，差异均有统计学意义(均P<0.01)；与地塞米松处理组这一阳性对照相比，Z-VAD-FMK处理组IFN-γ、IL-4、IL-17水平的差异均无统计学意义(均P>0.05)。见表2、图2。

表2 广谱caspase抑制剂Z-VAD-FMK对特应性皮炎患者外周血单一核细胞分泌IFN-γ、IL-4、IL-17的影响

图2 Z-VAD-FMK对特应性皮炎患者外周血单一核细胞分泌细胞因子的影响

3 讨论

特应性皮炎是一种慢性、反复发作的炎症性皮肤病，主要症状有剧烈的瘙痒、广泛的红斑脱屑等湿疹样皮损以及干皮症等，严重影响患者及其家人的生活。在过去30年中，许多国家特应性皮炎的患病率大幅度增加。特应性皮炎的发病机制尚不明确，目前认为AD是遗传、环境、皮肤屏障功能缺陷和免疫异常共同作用的多基因复杂疾病，CD4+T细胞介导的异常免疫反应一直是AD发病机制的研究热点。以往多项研究表明，Th2细胞占优势的Th1/Th2平衡失调是免疫介导的AD发生环节之一。Th17是新近发现的CD4+T细胞亚群，有研究显示，AD患者外周血和皮损中Th17细胞数量均增多，其百分比与疾病本身的严重程度相关[8,9]。

在本实验中，我们观察了AD患者外周血单一核细胞中Th1、Th2、Th17细胞的比例，发现与健康对照相比，Th1细胞明显下降，Th2与Th17细胞明显升高，这与其他学者的研究结果一致[2,9]。

近年来的研究表明，caspases不仅参与细胞凋亡，其在T细胞增殖与活化中亦发挥着重要作用。主要体现在以下方面：T细胞体外活化过程中检测到多种caspases的活性；caspase-8失活后导致了人与鼠T细胞免疫缺陷；体外实验中，caspase抑制剂能阻断抗CD3单抗、有丝分裂原及超抗原诱导的T细胞的增殖与活化。目前，关于在体内研究caspases在T细胞活化中的作用以及caspase抑制剂抗免疫反应的报道较少。Iwata等[10]将广谱caspase抑制剂Z-VAD-FMK应用于小鼠哮喘模型，他们发现，经尾静脉注射Z-VAD-FMK进行干预后，小鼠气道及肺血管中炎细胞浸润明显减少，黏液分泌及Th2细胞因子分泌也减少，T细胞在体外受到刺激后产生Th2细胞因子的能力也明显下降。我们既往研究亦表明，外用广谱caspase抑制剂Z-VAD-FMK治疗小鼠变应性接触性皮炎(ACD)有一定的疗效[5]，且可以抑制小鼠ACD的激发[6]。国内外尚未见到将其用于特应性皮炎的研究。

在本实验中，我们以特应性皮炎患者为研究对象，进一步观察了广谱caspase抑制剂Z-VAD-FMK对AD患者PBMCs培养上清液中IFN-γ、IL-4、IL-17的影响。参照既往文献报道[11]，Z-VAD-FMK的终浓度设为100 μmol/L，以PBS溶液为阴性对照，以250 nmol/L地塞米松溶液为阳性对照。结果发现，与阴性对照相比，Z-VAD-FMK处理组与地塞米松处理组IFN-γ、IL-4、IL-17水平均显著降低。这提示，广谱caspase抑制剂Z-VAD-FMK对AD患者外周血Th1、Th2、Th17等CD4+T细胞分泌相关细胞因子的能力均有抑制作用。本实验还发现，与地塞米松处理组这一阳性对照相比，Z-VAD-FMK处理组IFN-γ、IL-4、IL-17水平的差异均无统计学意义。这提示，广谱caspase抑制剂Z-VAD-FMK对AD患者外周血CD4+T细胞的抑制作用与250 nmol/L地塞米松相似。

有研究发现[7]，AD患者急性期皮损表皮角质形成细胞中caspase-3表达增加，但他们的研究结果局限在表皮内，没有观察真皮内浸润的淋巴细胞中caspases表达的情况，亦没有用caspase抑制剂进行干预并观察干预后的变化。在本实验中，我们观察了caspase抑制后对AD患者外周血CD4+T细胞的影响，今后可以对AD皮损中浸润的淋巴细胞进行相关研究，并进一步应用至动物模型中。

虽然已在部分炎症性疾病的动物实验中观察到caspase抑制剂抗免疫、抗炎症的作用，但尚未进行临床试验，考虑可能与相关研究仍较少有关。今后需要进行更多的研究进一步加以验证，为研制新型抗免疫及抗炎症药物提供依据。